產(chǎn)品及特點(diǎn)

TRIzol是美國Invitrogen公司的、用于總RNA提?。ㄖ饕莿?dòng)物總 RNA提取）的產(chǎn)品，具有廣大的客戶群。但其缺點(diǎn)之一是一直沒有柱式 升級(jí)產(chǎn)品，客戶仍然要使用既繁瑣又費(fèi)事的非柱式操作（另一缺點(diǎn)是不能用于 富含多糖和多酚的材料））為解決此問題，我們特推出本產(chǎn)品，主要特點(diǎn)是：跟TRIzol結(jié)合使用，把經(jīng)典操作變成了柱式操作，簡化了實(shí)驗(yàn)流程，用戶可 以節(jié)約 30 分鐘的時(shí)間。其他特點(diǎn)如下:

• RNA質(zhì)量更好，因?yàn)椴僮骱喍虦p少了 RNA 在提取過程中的降解。
• RNA純度更高，OD260/OD280 一般在 1.9 以上，比經(jīng)典 TRIzol 法得到的更純。
• 專門的洗滌條件能有效去除基因組 DNA，進(jìn)一步減少其對(duì) RNA 的污染。
• 適用于其他基于酸酚/ 異硫氰酸胍提取原理的RNA提取產(chǎn)品, 包括TRIzol、TRIzol LS、TRI Reagent 等。
• 可以省略氯處理步驟，避免接觸有毒試劑（但效果稍差））。

規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存

常溫運(yùn)輸和保存，有效期一年。

自備試劑

TRIzol 或 TRIzol 同類產(chǎn)品、氯

使用方法

• 按 TRIzol 的使用手冊(cè)進(jìn)行總 RNA 提取到加氯之前一步。
• 如果需要加氯，則繼續(xù)按TRIzol的使用手冊(cè)操作，用氯處理裂解液離心后得到上清液。如果省略氯處理步驟，則需要將裂解物直接離心。
• 將經(jīng)過氯處理得到的上清液或沒有經(jīng)過氯處理直接離心得到的裂解液轉(zhuǎn)移至一個(gè)干凈的 1.5 mL 塑料離心管中。注意：如果是經(jīng)過氯處理，則離心后，下層有機(jī)相和中間層將含有DNA和蛋白質(zhì)，避免觸及，否則將產(chǎn)生蛋白質(zhì)和 DNA 污染。為保險(xiǎn)起見，可以留下100 μL上清液不取。同時(shí)吸取上清時(shí)緩慢進(jìn)行，否則容易吸出交界面的不可見的絲狀DNA。
• 加入等體積的柱式動(dòng)物RNAout溶液B，顛倒混勻 30 秒。
• 根據(jù)混合物的多少，一次或分兩次轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。
• 每次轉(zhuǎn)移后，需要13000-15000 g室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。
• 加0.7 mL通用洗柱液到離心吸附柱中，室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。一次洗滌一般足夠去除雜質(zhì)。但如果樣品OD260/280比值不高，可以再用0.3 mL通用洗柱液重復(fù)此步一次。
• 室溫離心半分鐘。此步對(duì)去除殘留通用洗柱液十分重要，否則殘留的通用洗柱液會(huì)影響RNA的質(zhì)量和使用。
• 將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一自備的RNase-free收集管中，加入50-100 μL RNA洗脫液。
• 室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為RNA樣品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
• RNA完整性的電泳檢測(cè)：如果需要做Northern雜交，強(qiáng)烈建議用戶使用甲醛變性膠進(jìn)行RNA電泳，因?yàn)榉亲冃阅z不能分離所有的RNA分子（BioTechniques，28：414，2000）。
• RNA產(chǎn)量產(chǎn)率測(cè)定：將5-10 μL RNA溶于TE緩沖液中（pH 7.5-8.2 之間）檢測(cè)其在OD260的光吸收。通過光吸收可以得出RNA濃度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），進(jìn)而計(jì)算出RNA的產(chǎn)量（濃度 X 體積）和產(chǎn)率（RNA產(chǎn)量/組織用量）。
• RNA純度測(cè)定：無污染的總RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1 之間（具體數(shù)值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關(guān)），高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質(zhì)污染，但一般不影響RT-PCR等反應(yīng)。

疑難解答

Q：上樣孔里的紅色熒光物一定是DNA污染嗎？

A：不是。用TAE或TBE電泳液和非變性膠電泳RNA時(shí)容易產(chǎn)生此現(xiàn)象，天澤基因初步研究發(fā)現(xiàn)大部分紅色熒光物是變性不充分的單鏈RNA通過堿基互補(bǔ)或通過硼酸絡(luò)合（如果使用TBE作電泳液的話）形成的復(fù)合物，加RNase處理后，這些紅色熒光物（RNA）一般會(huì)消失。為避免此現(xiàn)象，建議使用甲醛變性膠電泳和RNA上樣液（如天澤基因的 RNAon）。

Q：如何確認(rèn)和去處除污染的基因組DNA？

A：如果懷疑有DNA污染，可以用RNase處理RNA樣品，然后再電泳。如果上樣孔里的紅色熒光物不消失，則表示是基因組DNA污染。進(jìn)一步確認(rèn)可以使用PCR擴(kuò)增法。去除污染的DNA可以使用天澤基因的非酶的 DNA去除劑DNA Erasol或RNase-free DNase，由于RNase-free DNase一般都有殘留的RNase污染，所以必須嚴(yán)格按照廠家提供的手冊(cè)進(jìn)行操作。