多抗和單抗的區(qū)別？

多抗是多個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對(duì)多種抗原表位的多種抗體混合物，單抗是一個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對(duì)一種抗原表位的的單一抗體。

多抗較單抗的優(yōu)勢(shì)是什么？

a.制備成本低廉，制備所需技術(shù)要求不高，制備周期短。

b. 能識(shí)別一個(gè)抗原上的多個(gè)表位，可在IP等實(shí)驗(yàn)中獲得更好的結(jié)果。

c. 多抗因?yàn)榘械鞍卓稍诙鄠€(gè)表位上結(jié)合不止一個(gè)抗體分子，有助于放大低表達(dá)水平的靶蛋白信號(hào)。

d. 能識(shí)別出與免疫原蛋白質(zhì)具有高同源性的蛋白質(zhì)，或者從非免疫原物種的組織樣品中篩選靶蛋白，例如當(dāng)未測(cè)試物種中的抗原性質(zhì)未知時(shí)，有時(shí)會(huì)使用多克隆抗體。e. 可識(shí)別多個(gè)結(jié)構(gòu)域，即使原始抗原的一些空間結(jié)構(gòu)或者序列發(fā)生小變化或者部分抗原決定簇變化，仍可以識(shí)別抗原，因此有更大的適應(yīng)性。

多抗較單抗的劣勢(shì)是什么？

a.容易產(chǎn)生批次間的差異

b. 產(chǎn)生大量的非特異性抗體，有時(shí)可能在某些應(yīng)用里產(chǎn)生背景信號(hào)。

單抗如何選擇？

如果對(duì)抗體的特異性要求高，用量較大或需要長(zhǎng)期使用一致的抗體，制備的抗體應(yīng)用要求多（WB/IP/IF/ICC等)，可以選擇制備單克隆抗體。

多抗如何選擇？

多抗相比較單抗仍然有制備時(shí)間短、制備成本低的特點(diǎn)，在一些情況下也是一種選擇。另外，在相同條件下，使用多抗可以提高檢測(cè)的靈敏度，對(duì)于豐度偏低的蛋白也更容易檢出。

WB, IHC, IP/ChIP類型抗體有什么區(qū)別?

WB:目前最常做的類型，WB識(shí)別的蛋白是經(jīng)過(guò)加熱變性之后都變成線性結(jié)構(gòu)的蛋白。

IHC:兔疫組化中需要進(jìn)行固定一步, 固定是為了盡量讓細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)維持和原有的一致。這種化學(xué)物質(zhì)的固定使蛋白

質(zhì)變性凝固，與天然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)有了一定的區(qū)別，但是又不同WB中加熱變性變成了線性的結(jié)構(gòu)。

IP/ChIP:這類實(shí)驗(yàn)是用抗體去結(jié)合生理狀態(tài)下的蛋白質(zhì)，因此IP和ChIP的抗體最好使用純化的天然蛋白制作的抗體。

目的蛋白分子量為何與實(shí)際不符?

當(dāng)條帶所示的實(shí)際大小與理論有偏差時(shí)，可能有以下原因?qū)е?蛋白發(fā)生如磷酸化、糖基化等翻譯后修飾時(shí)條帶會(huì)上移，蛋白發(fā)生剪切(如前體)時(shí)條帶會(huì)下移，蛋白存在不同的可變剪切體或亞型，強(qiáng)相互作用大分子存在時(shí)變性不徹底。

多抗做WB檢測(cè)為何有雜帶?

a. 從純化方式來(lái)看：采用ProteinA/G純化的多抗摻雜有動(dòng)物本身產(chǎn)生的對(duì)其自身抗原產(chǎn)生的抗體，這些抗體在檢測(cè)中會(huì)識(shí)別樣本中的蛋白而出現(xiàn)雜帶，可以采用抗原親和純化避免雜帶的產(chǎn)生。

b. 從蛋白修飾來(lái)看：天然蛋白存在復(fù)雜的翻譯后修飾。這點(diǎn)可以通過(guò)信息學(xué)分析進(jìn)行解釋。

c．從蛋白翻譯后加工來(lái)看：翻譯后蛋白前體經(jīng)切割可能會(huì)使部分蛋白分子量偏小，而天然組織中同時(shí)存在蛋白前體和切割加工后的蛋白，二者序列有相同部分，可能會(huì)產(chǎn)生雜帶。這點(diǎn)需要通過(guò)查閱與目的蛋白相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了解。

d．從同源家族蛋白來(lái)看：當(dāng)目的蛋白有同源家族蛋白時(shí)，蛋白異構(gòu)體的存在可能會(huì)使分子量偏離預(yù)測(cè)分子量，因?yàn)樘烊粯颖局杏赏粋€(gè)mRNA不同的剪接方式進(jìn)行翻譯形成的蛋白產(chǎn)物也會(huì)有相同的抗原表位，同時(shí)被抗體識(shí)別時(shí)會(huì)產(chǎn)生雜帶。

e. 從蛋白聚集形式來(lái)看：蛋白多聚體的形成，雖然還原條件可以抑制多聚體的形成，但是強(qiáng)烈的蛋白間相互作用在還原條件下也有可能不解聚導(dǎo)致條帶偏大。

抗體做WB為何不識(shí)別內(nèi)源樣本？

蛋白在天然樣本中的豐度太低，此時(shí)需要進(jìn)行富集或者過(guò)表達(dá)再進(jìn)行檢測(cè)。b. 如果豐度不低，單抗/多抗不識(shí)別內(nèi)源可能是該抗體識(shí)別的表位在天然蛋白中有修飾位點(diǎn)，此時(shí)需要對(duì)蛋白進(jìn)行修飾位點(diǎn)的分析。