對(duì)于養(yǎng)細(xì)胞的人來(lái)說(shuō)

可謂是談“污"色變

每次養(yǎng)細(xì)胞總讓人精神錯(cuò)亂

打開(kāi)培養(yǎng)皿的那一刻

連呼吸都是如此多余

只要有任何的異樣

無(wú)論是支原體還是雜菌

污染/污染/污染

猶如細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的魔宙

讓一切都無(wú)限重復(fù)

那么如何將失敗率降到更低，讓我們擺脫玄學(xué)的定律呢？

今天專門(mén)為大家盤(pán)點(diǎn)了細(xì)胞培養(yǎng)超實(shí)用干貨

細(xì)菌污染最為常見(jiàn)，一旦操作稍有不當(dāng)，就會(huì)引起細(xì)胞污染，細(xì)菌污染后顯微鏡下觀察呈現(xiàn)有黑色細(xì)條沙狀，當(dāng)然，根據(jù)感染的細(xì)菌不同，所呈現(xiàn)的狀態(tài)也不盡相同，有球形、桿狀等，其次，培養(yǎng)液發(fā)黃，變渾濁，可明顯看見(jiàn)培養(yǎng)皿中有細(xì)沙狀的沉淀物，時(shí)不時(shí)還有異樣氣味發(fā)出，如下圖所示：

處理方法：

　　在培養(yǎng)基中加入抗生素處理，可以用四環(huán)素，慶大霉素，或者鏈霉素，前兩者的工作濃度是50 μg/mL;鏈霉素的工作濃度是100 μg/mL。但是，細(xì)胞本身也有影響，狀態(tài)大不如從前，所以，防范于未然，正確操作、嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作規(guī)范，定期清理消毒培養(yǎng)設(shè)施才是關(guān)鍵!
二、真菌污染

　　真菌污染培養(yǎng)液清亮透明，不會(huì)像細(xì)菌感染大爆發(fā)，所以很難早期發(fā)現(xiàn)，鏡下有時(shí)候象絲狀，有時(shí)候象珊瑚狀，慢慢地會(huì)長(zhǎng)出很細(xì)的黑色絲狀物，這個(gè)時(shí)候，已經(jīng)晚了，細(xì)胞很難救活了。

處理方法：趕緊扔掉，不要再想挽救，即使再珍貴。然后*消毒滅菌培養(yǎng)間，CO2孵箱，器皿和培養(yǎng)液。

三、霉菌污染

　　同真菌感染一致，因?yàn)榕囵B(yǎng)液是清亮的，所以霉菌污染早期難以發(fā)現(xiàn)，等發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已經(jīng)為時(shí)過(guò)晚了。培養(yǎng)液中慢慢地出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，鏡下可見(jiàn)呈細(xì)絲狀的團(tuán)狀漂浮物，如同風(fēng)中柳絮，一般不仔細(xì)看發(fā)覺(jué)不出來(lái)。細(xì)胞仍可生長(zhǎng)，但時(shí)間一長(zhǎng)，細(xì)胞的狀態(tài)就變差，不再增長(zhǎng)。見(jiàn)下圖。

　　處理方法：建議果斷舍棄該污染細(xì)胞，將環(huán)境*消毒，因?yàn)槊咕念B固可能會(huì)導(dǎo)致下幾批細(xì)胞都會(huì)污染，所以，采用酒精*底地擦洗一遍CO2孵箱。然后再用新潔爾滅擦洗一遍，把水盤(pán)里加上飽和量的硫酸銅。千萬(wàn)不可大意

四、支原體感染

　　培養(yǎng)液變渾濁，支原體感染細(xì)胞以后，細(xì)胞病變不很明顯，只是細(xì)胞狀態(tài)變差、生長(zhǎng)變慢，在顯微鏡下觀察可能會(huì)有小黑點(diǎn)，但培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁。細(xì)胞傳代以后就出現(xiàn)細(xì)胞間黑點(diǎn)，細(xì)胞空泡化，很多類似凋亡、壞死的細(xì)胞，最終細(xì)胞漂浮，*死亡。

處理方法：

　　如果不是很珍貴的細(xì)胞的話，建議直接扔了吧。

五、黑膠蟲(chóng)污染

開(kāi)始污染時(shí)對(duì)細(xì)胞無(wú)影響，當(dāng)數(shù)量達(dá)到一定程度時(shí)就會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。400倍顯微鏡下可見(jiàn)點(diǎn)狀或片狀游動(dòng)小體，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會(huì)太影響，細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且觀測(cè)到的運(yùn)動(dòng)物無(wú)明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無(wú)明顯變化，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不會(huì)有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會(huì)自然消失，除更換血清外無(wú)須特殊處理。

　　處理方法：可以增加細(xì)胞的種板密度，以提高細(xì)胞的生存率，盡早處理細(xì)胞，越快越好。

根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)特性的不同，傳代可分為懸浮細(xì)胞傳代和貼壁細(xì)胞傳代兩種類型，對(duì)于懸浮細(xì)胞可采用加入等量新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散進(jìn)行傳代，或用離心法后，加入新培養(yǎng)基后再吹打分散進(jìn)行傳代；貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞則用消化法進(jìn)行傳代，下面我們介紹傳代培養(yǎng)的一些注意事項(xiàng)；

一、貼壁細(xì)胞傳代如何使用胰酶？

一般使用trypsin-EDTA濃度為0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。

消化液濃度過(guò)高時(shí)，易造成培養(yǎng)基中細(xì)胞碎片增多，黑渣子增多，常規(guī)細(xì)胞傳代時(shí)建議用0.05%的胰酶進(jìn)行消化，對(duì)于難消化的細(xì)胞可采用0.25%胰酶進(jìn)行消化，細(xì)胞密度過(guò)高超過(guò)80%時(shí)，采用分步消化法。胰酶儲(chǔ)存在–20°C，解凍在4°C進(jìn)行，第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于–20°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機(jī)會(huì)。

二、如何控制胰酶消化時(shí)間？

胰酶消化的程度是細(xì)胞培養(yǎng)中的一個(gè)關(guān)鍵步驟：消化過(guò)度細(xì)胞碎片增多，黑渣子增多，細(xì)胞會(huì)成片脫落，嚴(yán)重影響細(xì)胞活性，并有部分細(xì)胞漂浮，隨棄去的胰酶流失；消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷細(xì)胞活性。

不同細(xì)胞對(duì)消化液的敏感性不同，胰酶消化的時(shí)間也會(huì)有差異。胰酶消化時(shí)間與胰酶的濃度，是否含EDTA，胰酶的儲(chǔ)存時(shí)間，胰酶的儲(chǔ)存溫度，是否反復(fù)凍融，消化加入的胰酶體積，消化溫度及細(xì)胞的密度有關(guān)。消化對(duì)于新購(gòu)買的細(xì)胞，建議客戶先用低濃度的胰酶仔細(xì)去摸索一下消化時(shí)間，可每隔1分鐘鏡下觀察細(xì)胞是否變圓，記錄最佳消化時(shí)間，下一次操作參考之前的記錄來(lái)控制時(shí)間即可。

三、細(xì)胞抱團(tuán)怎么處理？

一些懸浮細(xì)胞抱團(tuán)生長(zhǎng)是正?，F(xiàn)象，大部分懸浮細(xì)胞在細(xì)胞密度很高的情況下，很可能會(huì)出現(xiàn)部分細(xì)胞抱團(tuán)生長(zhǎng)的現(xiàn)象，聚團(tuán)細(xì)胞很容易死亡并演化成絮狀物，殃及周圍的懸浮細(xì)胞，因此在培養(yǎng)懸浮細(xì)胞時(shí)需控制好細(xì)胞密度。如果出現(xiàn)了細(xì)胞團(tuán)，可以通過(guò)細(xì)胞篩去掉部分較大的細(xì)胞團(tuán)，也可以嘗試一下方法：將細(xì)胞懸液收集到15 ml離心管中，靜置20 min左右，小心取上層細(xì)胞上清培養(yǎng)（該方法只能去除部分較大的細(xì)胞團(tuán)）。

四、細(xì)胞內(nèi)有空泡，是否是正常現(xiàn)象？

部分細(xì)胞本身存在一定的空泡（如HepG2，Ishikawa及一些耐藥株等），這個(gè)是正?，F(xiàn)象。如果只有少數(shù)細(xì)胞有內(nèi)出現(xiàn)極少空泡，則很可能是細(xì)胞狀態(tài)不佳，可以通過(guò)調(diào)整血清濃度，控制消化，控制傳代比例及時(shí)間等方法來(lái)調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)；如果大部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡，且單個(gè)細(xì)胞內(nèi)空泡數(shù)目偏多，則可能細(xì)胞代次較高，細(xì)胞老化所致，需更換代次較早的細(xì)胞。

五、細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸變慢是什么原因？

細(xì)胞增殖變慢有以下原因：1. 消化過(guò)度 2. 傳代過(guò)密 3.細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良 4.細(xì)胞頻繁傳代 5.細(xì)胞狀態(tài)不佳或老化 6.細(xì)胞存在污染。

六、細(xì)胞何時(shí)進(jìn)行傳代較好？

一般情況下細(xì)胞生長(zhǎng)至*匯合后就應(yīng)該傳代，所有細(xì)胞生長(zhǎng)都有一個(gè)要求不宜生長(zhǎng)過(guò)密（也就是常說(shuō)的長(zhǎng)老了），但有接觸抑制的細(xì)胞，在匯合前就必須進(jìn)行傳代，這類細(xì)胞一般在密度70-80%就進(jìn)行傳代，否則會(huì)引起細(xì)胞分化。

一、復(fù)蘇

1）取出凍存管，立即放入37度水浴箱中快速解凍（1分鐘左右），水面不可沒(méi)過(guò)蓋子，以避免污染。

2）將凍存管移至無(wú)菌操作內(nèi)。打開(kāi)凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中，1000rpm, 5min，棄上清。

3）加入適量*培養(yǎng)基，置于37度恒溫箱中培養(yǎng)即可。

4）次日更換一次培養(yǎng)液,以去除任何殘留的冷凍保護(hù)劑，繼續(xù)培養(yǎng)。

二、凍存

1）用無(wú)菌吸管吸棄瓶?jī)?nèi)舊的培養(yǎng)基；

2）加入少量 PBS 沖洗二遍， 用胰蛋白酶把單層細(xì)胞消化下來(lái)，依據(jù)傳代的方法把細(xì)胞 懸液收集于離心管中，離心 1000 rpm，5-8 min； 

3）小心棄上清液，加入配置好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，然后將含有 細(xì)胞的凍存液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的凍存管中，每個(gè)凍存管加液 1-1.5 ml，細(xì)胞最終密度為 （5—10）×106 /ml； 

4）凍存管封口，做好標(biāo)記，按照以下程序凍存：

第一種方法：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1~-2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)到-25℃以下時(shí)，可增至-5℃~-10℃/min；到-150℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。

第二種方法：凍存管放入4℃，約30 min,﹣20℃ 30min- 60 min，見(jiàn)細(xì)胞懸液結(jié)凍后，放入﹣80 ℃冰箱， 過(guò)夜后轉(zhuǎn)入于液氮罐中。 

第三種方法：將凍存管放于程序降溫盒中，并置于-80℃冰箱4h以上，轉(zhuǎn)入液氮罐中長(zhǎng)期保存。