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            細胞計數(shù)與存活的測試實驗方法

            時間:2017/7/27閱讀:786
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            腫瘤細胞冷凍與復蘇是細胞培養(yǎng)的常規(guī)工作,可以解決細胞因為連續(xù)繼代造成的退變或轉化。細胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)以及細胞凍存和復蘇后都需要細胞計數(shù)。那么細胞計數(shù)與存活的測試實驗方法有哪些呢?
            1、原理:
            (1)計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coultercounter粒子計數(shù)器自動計數(shù)。
            (2)血球計數(shù)盤一般有二個chambers,每個chamber中細刻9個1mm2大正方形,其中4個角落之正方形再細刻16個小格,深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后,每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時,計數(shù)每個大正方形內之細胞數(shù)目,乘以稀釋倍數(shù),再乘以104,即為每ml中之細胞數(shù)目。
            (3)存活測試之步驟為dyeexclusion,利用染料會滲入死細胞中而呈色,而活細胞因細胞膜完整,染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypanblue染料,如果細胞不易吸收trypanblue,則用紅色之Erythrosinbluish。計算細胞活率:活細胞數(shù)/(活細胞數(shù)+死細胞數(shù))×100%。計數(shù)應在臺盼蘭染色后數(shù)分鐘內完成,隨時間延長,部分活細胞也開始攝取染料;因為臺盼蘭對蛋白質有很強的親和力,用不含血清的稀釋液,可以使染色計數(shù)更為準確。
            2、材料:
            0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061);Erythosinbluishstain;取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethylparaben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球計數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip);計數(shù)器(counter);低倍倒立顯微鏡;粒子計數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics)。腫瘤細胞稀釋液(4%乙酸溶液)。
            3、步驟:
            (1)取50μl細胞懸浮液與50μltrypanblue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。
            (2)取少許混合液(約15μl)自血球計數(shù)盤chamber上方凹槽加入,蓋上蓋玻片,于100倍倒立顯微鏡下觀察,活細胞不染色,死細胞則為藍色(或紅色-Erythrosinbluish)。
            (3)計數(shù)四個大方格之細胞總數(shù),再除4,乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2,因與trypanblue等體積混合),zui后乘以104,即為每ml中細胞懸浮液之細胞數(shù)。若細胞位于線上,只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。
            注:4大格細胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×104/4=細胞數(shù)/ml;每一大格的體積=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml計數(shù)板計數(shù)時,zui適濃度為5~10×105細胞/ml,此范圍外計數(shù)誤差偏大。高濃度細胞懸液,可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計數(shù)。
            5、范例:
            T75monolayerculture制成10ml細胞懸浮液,取0.1ml溶液與0.1mltrypanblue混合均勻于試管中,取少許混合液加入血球計數(shù)盤,計數(shù)四大方格內之細胞數(shù)目。
            活細胞數(shù)/方格:55,62,49,59;死細胞數(shù)/方格:5,3,4,6;細胞總數(shù)=243
            平均細胞數(shù)/方格=60.75;稀釋倍數(shù)=2;
            細胞數(shù)/ml:60.75×104×2(稀釋倍數(shù))=1.22×106;
            腫瘤細胞數(shù)/flask(10ml):1.22×106×10ml=12.2×106
            存活率:225/243﹦92.6%

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