轉化細胞實驗試劑
1. 細胞營養(yǎng)液（DMEM液體培養(yǎng)基，10％胎牛血清，雙抗100單位/ml），消化液（0.05％胰酶，0.53mM EDTA·Na），Hank’s液。
2. 2×HBS液（280mMNaCl, 10mMKCl, 1.5mMNaHPO4·2H2O, 12mM葡萄糖，50mMHepes，pH7.05, 0.2μ過濾除菌），CaCl2（2.5M，0.2μ過濾除菌）溶液，超純水（滅菌）。
3. PBS，蛋白酶K，NP40，RNaseA，無水乙醇，酚，DNA上樣緩沖液，瓊脂糖，TAE電泳緩沖液，EB。
實驗設備
1. 10cm細胞培養(yǎng)皿
2. 50ml、15ml一次性離心管
3. 10ml玻璃吸管（滅菌），與玻璃吸管配套的吸球及膠管
4. 二氧化碳培養(yǎng)箱
5. 倒置顯微鏡
6. 20μl，200μl微量移液器
7. 1.5ml離心管（滅菌）
8. 200μl微量移液器頭
9. 1ml微量移液器
10. 低速臺式離心機
11. 高速臺式離心機
12. 4°C，－20°C冰箱
13. DNA凝膠電泳設備
14. 紫外凝膠成像儀
實驗材料
胚腎細胞系293，TNF－R1哺乳動物細胞表達質粒（CsCl超速離心純），哺乳動物細胞表達載體（CsCl超速離心純）。
實驗步驟
1. 293細胞的傳代培養(yǎng)（*天） 
   1） 顯微鏡觀察母細胞的生長狀態(tài)，確定傳代比例。 
為了獲得較高的轉染效率，必需保證細胞處于合適的生長密度，因此應根據(jù)母細胞的生長密度調整傳代比例。磷酸鈣轉染的合適細胞密度為50％－70%，本實驗中使用的293細胞長成致密單層后一般按照1：6傳代即可。 
   2） 在酒精燈旁打開培養(yǎng)皿蓋，倒去皿中的細胞營養(yǎng)液，加入2mlHank’s液，輕輕搖動，將溶液倒出。 
   3） 消化與分裝。 
在培養(yǎng)皿中加入1ml消化液（0.53mMEDTA, 0.05%胰蛋白酶液），37°C靜置5分鐘左右，顯微鏡觀察，如果細胞變圓且彼此分離表明消化*，此時可加入10ml營養(yǎng)液終止消化，吹打數(shù)次，使培養(yǎng)皿壁上的細胞全部脫落下來，并分散形成均勻的細胞懸液。按照傳代的比例補加適當體積的營養(yǎng)液，吹打混勻后分裝到新的培養(yǎng)皿中。 
在分裝好的細胞培養(yǎng)皿上做好標記，置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 
2. 用磷酸鈣介導的外源質粒轉染法在293細胞中過量表達TNF－R1（第二天） 
   1） 顯微鏡觀察待轉染細胞的生長狀態(tài) 
      a. 觀察細胞是否污染 
      b. 觀察培養(yǎng)液顏色的變化 
      c. 觀察細胞的生長密度 
   2） 轉染 
      a. 用微量移液器在1.5ml離心管中依次加入10μg（1μg /μl, 10μl）質粒DNA（實驗組為TNF-R1的哺乳動物細胞表達載體，對照組為空載體），350μl超純水，40μlCaCl2（2.5M）溶液，混勻。 
      b. 在另一1.5ml離心管中加入400μl2×HBS，將A液分三次緩慢加入，每次加入A液后用吹氣泡的方法混勻。室溫靜置5分鐘。 
      c. 將A，B混合液均勻地滴加在待轉染的293細胞培養(yǎng)液中，輕輕晃動使混勻。將培養(yǎng)皿置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中。 
3. 轉化細胞的形態(tài)觀察，“DNA Ladder”的提取及瓊脂糖電泳分析（第三天） 
   1） 顯微鏡觀察過量表達TNF-R1（實驗組）和空載體（對照組）的293細胞形態(tài)上的差異。 
   2） 用10ml玻璃吸管將實驗組和對照組培養(yǎng)皿中的細胞輕輕吹打下來，收集到15ml離心管中，2000rpm離心5分鐘，沉淀用1mlPBS重懸，轉移到1.5ml離心管中，2000rpm離心3分鐘，去除上清液，加入200μlPBS（0.2mg/ml 蛋白酶 K），重懸細胞，再加入200μlPBS（2％NP40），顛倒混勻，4°C作用30分鐘，期間顛倒數(shù)次。12,000rpm離心2分鐘，吸出上清，加入1ml乙醇，顛倒混勻，－20°C靜置10分鐘，12,000rpm離心10分鐘，沉淀溶于50μl水中，加入RNaseA（10mg/ml），37°C靜置20分鐘。 
   3） 在DNA溶液中加入10μlDNA上樣緩沖液，取出50μl進行2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀拍照。
含量測定    100mg    130568-200501    莫匹羅星
含量測定    100mg    130569-200601    替卡西林
紅外鑒別    100mg    130570-200501    磷霉素鈉
含量測定    200mg    130572-200701    頭孢西丁
鑒別    50mg    130573-200701    1,3－萘二酚
有關物質    50mg    130576-200901    克林霉素B
有關物質    100mg    130579-200901    反式頭孢吡肟
HPLC含量    100mg    130585-201001    巴洛沙星
有關物質    50mg    130601-201001    環(huán)丙沙星雜質B
有關物質    50mg    130605-201001    環(huán)丙沙星雜質Ⅰ
有關物質    50mg    130650-200901    阿奇霉素雜質J
轉化細胞