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            成纖維細(xì)胞排除法操作流程

            時(shí)間:2017/3/7閱讀:828
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            1.原代細(xì)胞機(jī)械刮除法:

            是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲)、或裹少許脫脂棉制成,裝入試管中高壓滅菌后備用(也可用特制電熱燒灼器刮除)。刮除程序?yàn)椋?/p>

            (1)標(biāo)記:鏡下觀察,用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細(xì)胞的部位;

            (2)刮除:棄掉培養(yǎng)液,把無菌膠刮伸入瓶皿中,肉眼或顯微鏡窺視下,刮除無標(biāo)記空間;

            (3)用Hanks液沖洗一兩次,洗除被刮掉的細(xì)胞;

            (4)注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留,可重復(fù)刮除至*除掉為止

            2.反復(fù)貼壁法:

            根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn),并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液,把含有兩類細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁,使兩類細(xì)胞相互分離,操作方法與傳代相同。

            (1)待原代細(xì)胞生長達(dá)一定數(shù)量后,倒出舊培養(yǎng)液,用胰酶消化后,Hanks 沖洗2次,加入不含血清的培養(yǎng)液,吹打制成細(xì)胞懸液;

            (2)取編號為此A、B、C三個(gè)培養(yǎng)瓶;首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)5~20分鐘后,輕輕傾斜培養(yǎng)瓶,讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液,再接種入B培養(yǎng)瓶中后;向A瓶中補(bǔ)充少許*培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng);

            (3)培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞5~20分鐘后,接處理A的方法,把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中;再向B瓶中補(bǔ)加*培養(yǎng)基。

            當(dāng)三個(gè)瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)液后,均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功,次日觀察可見A瓶主要為成纖維細(xì)胞,B瓶兩類細(xì)胞相雜,C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時(shí)可反復(fù)處理多次,直至癌細(xì)胞純化為止。

            3.消化排除法:

            此法曾用于乳癌細(xì)胞的培養(yǎng),具體程序是:

            (1)先是用0.5%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次,然后再換成新的混合液繼續(xù)消化,并在倒置顯微鏡下窺視和不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶,到半數(shù)細(xì)胞脫落下來后,便立即停止消化;

            (2)把消化液吸入離心管中,離心去上清,吸入另瓶中,加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng);向原瓶內(nèi)也補(bǔ)加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后,成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落。經(jīng)過幾次反復(fù)處理,可能把成纖維細(xì)胞除凈。

            4.膠原酶消化法:

            本法是利用成纖維細(xì)胞對膠原酶較為敏感的特點(diǎn),通過消化進(jìn)行選擇。

            (1)可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理,邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視,當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后,即終止消化;

            (2)用Hanks洗滌處理一次后,更換新培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng),可獲純凈腫瘤細(xì)胞。如成纖維細(xì)胞未被除凈,可再次重復(fù)。

            5.其它方法:

            有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細(xì)胞生長的作用;也有人用聚蔗糖制備成比重1.025~1.085的密度梯度離心液,加入細(xì)胞懸液后,在23℃中800g離心 10分種。在比重1.025~1.050層為成纖維細(xì)胞,在比重1.050~1.085層為上皮細(xì)胞,再經(jīng)過分離進(jìn)行培養(yǎng)。zui近也有人應(yīng)用特殊化學(xué)物如SOD抑制成纖維細(xì)胞生長的方法。

            選用上述任何一種方法,都需進(jìn)行試驗(yàn),取得必要經(jīng)驗(yàn),找出適合的條件,原代細(xì)胞才能獲得好的效果。

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