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細胞系從基層迅速分離細胞，且保持細胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味著對于所有細胞系的廣泛應用，每一種系統(tǒng)*條件和施用濃度應該根據(jù)經驗加以確定。
再次培養(yǎng)時檢測細胞的活性。
細胞的活率應該超過90%
對于無血清培養(yǎng)基，降低胰蛋白酶使用量。
1. 移棄使用過的細胞培養(yǎng)基。
2. 使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸.)清洗細胞系(看表確定正確的清洗溶液)。在培養(yǎng)瓶對著細胞的一面加入清洗溶液，通過轉動培養(yǎng)瓶1到2分鐘清洗細胞層，然后去除清洗液。
3. 以2～3ml/25cm2的量，加選擇的分離液(見表)到培養(yǎng)瓶對著細胞的一面。確保分離液覆蓋細胞層。在37℃孵育培養(yǎng)瓶，輕輕搖動培養(yǎng)瓶。通常，在5到15分鐘內，細胞就會脫落。細胞分離需要的時間因細胞系不同而有所變化。仔細監(jiān)測細胞分離過程，避免細胞受損傷。對難于從培養(yǎng)瓶基層分離的細胞系，可以輕輕敲打，以加速分離過程。
4. 當細胞*分離時，垂直放置培養(yǎng)瓶，讓細胞流到培養(yǎng)瓶的底部。在培養(yǎng)瓶中加入*培養(yǎng)基，通過移液管在單層細胞表面反復吹打來分散細胞。計數(shù)并再次培養(yǎng)細胞系。
5. 對于無血清培養(yǎng)基，加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1(v∶v)0.25mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性。
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