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(一)活細(xì)胞系吸收試驗(yàn)
原理
將過(guò)量的待測(cè)細(xì)胞與*細(xì)胞因子共孵育,若細(xì)胞膜表面存在相應(yīng)的細(xì)胞因子受體即可結(jié)合細(xì)胞因子,通過(guò)測(cè)定前、后細(xì)胞因子生物活性的對(duì)比情況可推測(cè)待測(cè)細(xì)胞表面細(xì)胞因子受體是否存在。
方法
1.過(guò)量的待測(cè)細(xì)胞、適量細(xì)胞因子準(zhǔn)備。
2.共孵育,時(shí)間根據(jù)待測(cè)細(xì)胞和細(xì)胞因子選擇。可設(shè)2h,4h,6h,8h和更長(zhǎng)時(shí)間。
3.離心(1500r/min, 5分鐘)收集上清液。
4.測(cè)定孵育前后的細(xì)胞因子活性。方法同細(xì)胞因子測(cè)定。
注意事項(xiàng)
此法簡(jiǎn)便,適用于定性,但不適用于定量檢測(cè)。
(二)核素標(biāo)記重組細(xì)胞因子的放射受體分析
該方法是確定細(xì)胞因子受體分布及其特性的主要方法,可測(cè)定細(xì)胞受體的數(shù)量及親和力。通常標(biāo)記的方法有以下兩種:
1.重組細(xì)胞系因子和核素體體外共孵育。
2.利用cDNA轉(zhuǎn)錄獲得足夠量的細(xì)胞因子mRNA,注入非洲爪蟾卵母細(xì)胞內(nèi),在體外翻譯的底物中加入核素標(biāo)記的氨基酸(如35S-Met或3 H-Leu等)。通過(guò)生物合成內(nèi)標(biāo)記產(chǎn)生的重組細(xì)胞因子的功能不受影響,因此適用于某些穩(wěn)定性較差的細(xì)胞因子的檢測(cè)。
(三)可溶性細(xì)胞因子受體的檢測(cè)
細(xì)胞因子受體除存在于細(xì)胞膜外,尚有部分細(xì)胞因子受體可分泌進(jìn)入體液,稱為可溶性細(xì)胞因子受體(solublecytokinereceptor),如sIL-2R,sIL-4R和slFN-yR。這類(lèi)受體多采用免疫學(xué)方法檢測(cè)故在此不作介紹。
(四)抗受體McAb法
利用細(xì)胞因子的McAb既可通過(guò)封閉受體抑制相應(yīng)細(xì)胞因子的生物學(xué)活性進(jìn)行受體檢測(cè),也可用標(biāo)記的McAb直接作免疫放射受體分析或免疫沉淀。
(五)重組細(xì)胞因子RIA法
利用化學(xué)交聯(lián)劑將標(biāo)記的重組細(xì)胞因子與膜受體交聯(lián),細(xì)胞裂解物經(jīng)PAGE后進(jìn)行放射自顯影分析,通過(guò)帶型分析可確定受體的分子量及亞單位。
(六)受體cDNA分析
分子克隆是在基因水平上研究細(xì)胞系因子受體的*途徑,通過(guò)核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸順序進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能區(qū)分析,是深入探討受體作用機(jī)制的基礎(chǔ)。此外還可利用基因工程技術(shù)重組受體子。目前已有10多種細(xì)胞因子受體的基因被克隆出來(lái),包括IL-1R, IL-2Ra及IL-3R,IL-4R,IL-6R,IL-7R,INF/R,MPOR,M-CSFR等。
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