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當(dāng)前位置:上海研生實(shí)業(yè)有限公司>>技術(shù)文章>>原代細(xì)胞計(jì)數(shù)的操作步驟
(一)原代細(xì)胞計(jì)數(shù)
1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用擦試干凈,并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。
2、將細(xì)胞懸液吸出少許,滴加在蓋片邊緣,使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。
3、靜置3分鐘。
4、鏡下觀察,計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù),壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算:
細(xì)胞數(shù)/ml=4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×10000
注意:鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算,若細(xì)胞團(tuán)占10%以上,說明分散不好,需重新制備細(xì)胞懸液。
(二)原代細(xì)胞活力
1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中。
2、加入0.5ml 0.4%臺(tái)盼蘭染液,染色2一3分鐘。
3、吸取少許懸液涂于載玻片上,加上蓋片。
4、鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù),計(jì)細(xì)胞活力。
死細(xì)胞能被臺(tái)盼蘭染上色,鏡下可見深蘭色的細(xì)胞,活細(xì)胞不被染色,鏡下呈無色透明狀。
活力測定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來進(jìn)行,但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。
(三)MTT法測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力
活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲贊顆粒積于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍。其量與細(xì)胞數(shù)呈正比,也與細(xì)胞活力呈正比。
l、細(xì)胞懸液以1000rpm離心10分鐘,棄上清液。
2、沉淀加入0.5-1ml MTT,吹打成懸液。
3、37℃下保溫2小時(shí)。
4、加入4—5 ml酸化異丙醇(定容)。打勻。
5、1000 rpm離心,取上清液酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)570nm比色,酸化異丙醇調(diào)零點(diǎn)。
注意:MTT法只能測定原代細(xì)胞相對數(shù)和相對活力,不能測定細(xì)胞數(shù)。
附:1、0.4%臺(tái)盼蘭染液配制:
臺(tái)盼蘭 0.4克 加雙蒸水至100 ml。
2、MTT配制:
MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸緩沖液或無酚紅的基礎(chǔ)液中。4℃下保存。
3、酸化異丙醇配制:
異丙醇中加入HCl使zui終達(dá)0.04mol/L。
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