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            上海研生實(shí)業(yè)有限公司
            中級(jí)會(huì)員 | 第10年

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            細(xì)胞
            elisa酶聯(lián)免疫試劑盒
            生化試劑
            PCR試劑盒
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            科研細(xì)胞
            天然蛋白、重組蛋白

            過氧化物酶標(biāo)記測定法原理

            時(shí)間:2017/3/23閱讀:2157
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            腫瘤細(xì)胞原理:脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[(digoxigenin)-11-dUTP]在TdT酶的作用下,可以摻入到凋亡細(xì)胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端,與dATP形成異多聚體,并可與連接了報(bào)告酶(過氧化物酶或堿性磷酸酶)的抗地高辛抗體結(jié)合.在適合底物存在下,過氧化物酶可產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng),特異準(zhǔn)確的定位出正在凋亡的細(xì)胞,因而可在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察.

            毛地黃植物是地高辛的*來源.在所有動(dòng)物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結(jié)合的配體,因而非特異性反應(yīng)很低.抗地高辛的特異性抗體與脊椎動(dòng)物甾體激素的交叉反應(yīng)不到1%,若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后,則可*排除細(xì)胞Fc受體非特異性的吸附作用.

            (一)試劑配制

            1、磷酸緩沖液PBS(pH7.4):磷酸鈉鹽 50mM,NaCl 200mM.

            2、蛋白酶K(200μg/ml,pH7.4):蛋白酶K 0.02g;PBS 100ml.

            3、含2%H2O2的PBS緩沖液(pH7.4):H2O2 2.0ml;PBS緩沖液 98.0ml.

            4、TdT酶緩沖液(新鮮配):Trlzma堿 3.63g用 0.1N HCl調(diào)節(jié)pH至 7.2,加ddH2O定容到1000ml;

            5、TdT酶反應(yīng)液:TdT酶32μl;TdT酶緩沖液 76μl,混勻,置于冰上備用.

            6、洗滌與終止反應(yīng)緩沖液:氯化鈉 17. 4g;檸檬酸鈉 8.82g;ddH2O 1000ml

            7、0.05%二氨基聯(lián)苯(DAB)溶液:DAB 5mg;PBS 10ml,pH7.4, 臨用前過濾后,加過氧化氫至0.02%.

            8、0.5%甲基綠(pH4.0):甲基綠0.5g;0.1M乙酸鈉100ml.

            9、100%丁醇,100%、95%、90%、80%和70%乙醇,二甲苯,10%中性甲醛溶液,乙酸,松香水等.

            10、過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體(ONCOR)

            (二)腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟

            1、標(biāo)本預(yù)處理:

            (1)石蠟包埋的組織切片預(yù)處理:將組織切片置于染色缸中,用二甲苯洗兩次,每次5min.用無水乙醇洗兩次,每次3min.用95%和75%乙醇各洗一次,每次3min.用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液(20ug/ml),于室溫水解15min,去除組織蛋白.用蒸餾水洗4次,每次2min,然后按下述步驟2進(jìn)行操作.

            (2)冰凍組織切片預(yù)處理:將冰凍組織切片置10%中性甲醛中,于室溫固定10min后,去除多余液體.用PBS洗兩次,每次5min.置乙醇:乙酸(2:1)的溶液中,于-20℃處理5min,去除多余液體.用PBS洗兩次,每次5min,然后按下述步驟2進(jìn)行操作.

            (3)培養(yǎng)的或從組織分離的細(xì)胞的預(yù)處理:將約 5 × 107個(gè)/ml細(xì)胞于 4%中性甲醛室溫中固定 10min.在載玻片上滴加 50~100μl細(xì)胞懸液并使之干燥.用PBS洗兩次,每次5min,然后按下述步驟2進(jìn)行操作.

            2、色缸中加入含2%過氧化氫的PBS,于室溫反應(yīng)5min.用PBS洗兩次,每次5min.

            3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體,立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液,置室溫1~5min.

            4、用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體,立即在切片上滴加 54μl TdT酶反應(yīng)液,置濕盒中于37C反應(yīng) 1hr(注意:陰性染色對(duì)照,加不含TdT酶的反應(yīng)液).

            5、將切片置于染色缸中,加入已預(yù)熱到37℃的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液,于37℃保溫30min,每10min將載玻片輕輕提起和放下一次,使液體輕微攪動(dòng).

            6、組織切片用PBS洗 3次,每次 5min后,直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體,于濕盒中室溫反應(yīng)30min.

            7、用PBS洗4次,每次5min.

            8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05%DAB溶液,室溫顯色3~6min.

            9、用蒸餾水洗4次,前3次每次1min,zui后1次5min.

            10、于室溫用甲基綠進(jìn)行復(fù)染10min.用蒸餾水洗3次,前兩次將載玻片提起放下10次,zui后1次靜置30s.依同樣方法再用100%正丁醇洗三次.

            11、用二甲苯脫水3次,每次2min,封片、干燥后,在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

            (三)腫瘤細(xì)胞注意事項(xiàng)

            細(xì)胞凋亡檢測試驗(yàn)中一定要設(shè)計(jì)陽性和陰性對(duì)照樣本。可以采用不加TdT酶的作為陰性對(duì)照組,利用DNaseI部分降解的細(xì)胞作為陽性對(duì)照組。

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