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1. 原代細(xì)胞凍存復(fù)蘇技術(shù)簡介
在ELISPOT檢測(cè)的應(yīng)用中,往往需要用到凍存的淋巴細(xì)胞樣品作為檢測(cè)細(xì)胞。由于ELISPOT檢測(cè)的是細(xì)胞的免疫功能,不僅僅需要保持細(xì)胞的存活率,而且還要保證細(xì)胞的功能不發(fā)生變化。傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存方法通常是為了保存細(xì)胞株,對(duì)細(xì)胞存活率的要求不高,更沒考慮保持細(xì)胞原有的免疫狀態(tài),所以傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存方法已經(jīng)不能滿足ELISPOT檢測(cè)的要求。參見圖7.1。
考慮到ELISPOT檢測(cè)的特殊性,荷蘭U-CyTech公司經(jīng)過精心的研究與反復(fù)的驗(yàn)證,推出了Cryostar™凍存試劑盒,在凍存液中添加了一系列對(duì)細(xì)胞有特殊保護(hù)作用的保護(hù)劑。達(dá)科為公司在接到Cryostar™凍存試劑盒之后,在我們的實(shí)驗(yàn)室以及國內(nèi)數(shù)家客戶的實(shí)驗(yàn)室做了細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的實(shí)驗(yàn),并且對(duì)復(fù)蘇之后的細(xì)胞做了ELISPOT檢測(cè)。結(jié)果表明,淋巴細(xì)胞的存活率超過90%,ELISPOT斑點(diǎn)形成頻率與新鮮細(xì)胞*相同。
2. 細(xì)胞凍存、復(fù)蘇的標(biāo)準(zhǔn)程序
l 實(shí)驗(yàn)儀器:
² 可控溫度細(xì)胞離心機(jī)離心機(jī);
² 血球計(jì)數(shù)板或者自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)備;
² 細(xì)胞程序降溫盒Nalgene “Mr. Frosty”;
² -70°C冰箱;
² 液氮罐;
² 37°C水浴鍋。
l 耗材準(zhǔn)備
² 15ml圓錐底聚丙烯(PP)離心管;
² 無菌的原代細(xì)胞凍存管,2ml,外螺旋;
l 試劑配制
² 熱失活補(bǔ)體胎牛血清;
² R0培養(yǎng)基:RPMI-1640培養(yǎng)基,含谷氨酰胺,加入1%雙抗,不加血清。
² 達(dá)優(yōu)®無血清培養(yǎng)基:已經(jīng)含有谷氨酰胺和雙抗,打開即用。
² Cryostar™重懸液(Cryostar™ Resuspension Medium):含有細(xì)胞凍存保護(hù)成分,-20°C長期保存,4°C可以保存6個(gè)月。
² Cryostar™ 2×凍存液(Cryostar™ Freezing Medium):含有原代細(xì)胞凍存保護(hù)成分以及DMSO,-20°C長期保存,4°C可以保存6個(gè)月。
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