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            上海研生實(shí)業(yè)有限公司
            中級(jí)會(huì)員 | 第10年

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            細(xì)胞
            elisa酶聯(lián)免疫試劑盒
            生化試劑
            PCR試劑盒
            標(biāo)準(zhǔn)品
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            科研細(xì)胞
            天然蛋白、重組蛋白

            原代細(xì)胞生長的檢查方法

            時(shí)間:2018/3/8閱讀:541
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            1.原代細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法
            是zui簡單的檢測細(xì)胞生長的方法。計(jì)數(shù)細(xì)胞一般利用臺(tái)盼藍(lán)(錐蟲藍(lán)染色,臺(tái)盼藍(lán)(錐蟲藍(lán))不能透過活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜,故活細(xì)胞不著色。而死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增高,可使染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而使細(xì)胞著色。因此,鏡下未染色細(xì)胞認(rèn)為是活細(xì)胞,而染色細(xì)胞認(rèn)為是死亡細(xì)胞。
            經(jīng)典的細(xì)胞計(jì)數(shù)常用到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板。細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞后,將細(xì)胞懸液加入血蓋片和計(jì)數(shù)板之間的空隙中,通常我們計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)板的四角大方格(每個(gè)大方格又分16個(gè)小方格)內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。計(jì)完數(shù)后,需換算出每ml懸液中的細(xì)胞數(shù)。由于計(jì)數(shù)板中每一方格的面積為0. 01cm2,高為0. 01cm,這樣它的體積為0. 0001cm3,即0.1mm3。由于1ml=1000mm3,所以每一大方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)×10 000=細(xì)胞數(shù)/ml,可按下式計(jì)算:細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)/ml=4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4×10000。如計(jì)數(shù)前己稀釋,可再乘稀釋倍數(shù)。計(jì)數(shù)細(xì)胞后,可以根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果,以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo),以天數(shù)為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。
            目前也有多家公司自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,如lifetechnology、Bio-rad等公司。自動(dòng)計(jì)數(shù)儀將圖像輸入電腦后自動(dòng)計(jì)數(shù),消除了手動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)的主觀性,消除了用戶之間的差異性,可以快速準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)細(xì)胞,并同時(shí)檢測細(xì)胞存活率及平均大小。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步,有公司也推出了直接計(jì)數(shù)細(xì)胞的分析儀器,如Roche旗下Innovatis公司的CASY系列細(xì)胞計(jì)數(shù)分析系統(tǒng),CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)儀采用*的電脈沖三維掃描分析技術(shù)。它突破了傳統(tǒng)二維細(xì)胞成像分析技術(shù)和染色法的局限,提供更加的細(xì)胞計(jì)數(shù)和分析功能。無需購買染色劑,即可、快速地定量細(xì)胞濃度、體積、成團(tuán)和碎片。它根據(jù)測量的體積來計(jì)算細(xì)胞成團(tuán),即使是嚴(yán)重成團(tuán)的細(xì)胞,它也能正確定量。細(xì)胞死亡時(shí),細(xì)胞膜會(huì)破損,CASY測得的是細(xì)胞核的體積,根據(jù)體積大小的差別,我們可以區(qū)分活細(xì)胞、死細(xì)胞以及細(xì)胞碎片。
            2.檢測DNA合成
            檢測DNA合成是目前檢測細(xì)胞增殖zui準(zhǔn)確可靠的方法,目前常用的方法有如下幾種:
            (1)3H-胸腺嘧啶核苷滲入法(3H-TdR):胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA合成的前體物,處于S期的細(xì)胞不斷地?cái)z取TdR用以合成DNA。3H-TdR摻入法是將被放射性標(biāo)記的3H-TdR摻入DNA合成期的細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)3H-TdR摻入量的多少可客觀反映細(xì)胞復(fù)制DNA能力的大小,從而問接了解細(xì)胞增殖情況。通過檢測。H放射活性即可反映DNA含量。
            1976年Mattem等首先采用此方法做體外藥敏試驗(yàn)。此后經(jīng)過長期的廣泛研究,也己證實(shí)該法對各種動(dòng)物腫瘤及人類腫瘤均有較好的預(yù)測價(jià)值和重復(fù)性,主要用于細(xì)胞增殖的檢測與藥物敏感性試驗(yàn)等。但這種方法操作復(fù)雜,試劑含有同位素,具有放射性,對實(shí)驗(yàn)者有一定的危害,故限制了它的應(yīng)用。
            (2)BrdU檢測法:BrdU中文全名為5-溴脫氧尿嘧啶核苷,為胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期)摻入,而后利用抗BrdU的抗體耦聯(lián)不同的酶,加入不同發(fā)光特性的底物,然后再通過比色法、化學(xué)發(fā)光檢測或熒光信號(hào)檢測底物強(qiáng)度等步驟,反映BrdU的摻入量。該方法不需要再和放射性物質(zhì)打交道。
            (3)EdU檢測法:BrdU雖然解決了接觸同位素的問題,但原代細(xì)胞該方法需要變性DNA后才能與抗體結(jié)合,但這就破壞了DNA雙鏈結(jié)構(gòu),對某些后續(xù)或同時(shí)進(jìn)行的試驗(yàn),如其他染料的結(jié)合染色有影響?,F(xiàn)在有一種新的檢測方法能避免這種情況的發(fā)生——EdU檢測。EdU(5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷)也是一種胸腺嘧啶核苷類似物,但其連有的炔羥基團(tuán)在天然化合物中很少見,在細(xì)胞增殖時(shí)能夠插入正在復(fù)制的DNA分子中,基于EdU與染料的共軛反應(yīng)可以進(jìn)行快速的細(xì)胞增殖檢測分析,可以有效地檢測處于S期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。與傳統(tǒng)的免疫熒光染色(BrdU)檢測方法相比,更簡單,更快速,更準(zhǔn)確。
            HPLC法含量測定    50mg    100679-200401    美洛昔康
            含量測定    100mg    100680-200901    乙酰苯柳胺
            HPLC法含量測定    100mg    100681-200501    鹽酸布替奈芬
            HPLC法含量測定    100mg    100682-200401    消旋卡多曲
            HPLC法含量測定    100mg    100683-200401    鹽酸托烷司瓊
            HPLC法含量測定    100mg    100684-200401    利魯唑
            UV法含量測定    100mg    100685-200401    坎地沙坦酯
            含量測定    100mg    100686-200401    鹽酸司他斯汀
            含量測定    100mg    100687-200401    鹽酸二甲弗林
            原代細(xì)胞

             

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