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RIP(RNA Immunoprecipitation)和RNA pull-down等實驗技術是我們深入研究RNA和蛋白質(zhì)相互作用的關鍵工具。RIP運用目標蛋白的特異性抗體分離純化與蛋白相互作用的RNA，RNA pull-down通過RNA探針捕獲與之相互作用蛋白質(zhì)。上文我們詳細了解了RIP技術，今天帶大家了解一下RNA pull-down技術。

RNA pull-down

RNA pull-down是研究細胞內(nèi)RNA與蛋白/RNA結合情況的技術。先將RNA進行標記（如生物素標記），再與細胞裂解液共同孵育，從而形成RNA-RNA/蛋白質(zhì)復合物，進而檢測與之結合的RNA或蛋白質(zhì)。復合物洗脫后，通過熒光定量PCR(RNA pull down-QPCR)或高通量測序(RNA pull down-seq)方法來鑒定目標RNN是否與某些RNA分子相互作用，通過Western blot(pull down-WB)實驗和質(zhì)譜(pull down--MS)技術檢測目標RNA是否與某些蛋白相互作用。

RNA Pull down技術原理

RNA pull down實驗的大致流程：

1、探針制備

設計并合成含有T7啟動子的特異性引物。

使用含有目的基因的質(zhì)粒作為模板進行PCR擴增。

利用PCR產(chǎn)物作為模板進行體外轉錄，獲得目的RNA。

對目的RNA進行標記，通常使用生物素標記。

2、細胞裂解液準備

收集細胞并裂解，制備細胞裂解液。

通過離心去除細胞碎片，收集上清液。

3、RNA-蛋白質(zhì)復合物形成

將標記的RNA探針與細胞裂解液混合，在適宜條件下孵育，使得RNA與潛在的蛋白質(zhì)結合并形成復合物。

4、磁珠結合與洗滌

加入鏈霉親和素磁珠，這些磁珠能夠與生物素標記的RNA結合。

顛倒混勻，使磁珠與RNA-蛋白質(zhì)復合物充分接觸并結合。

通過磁場分離磁珠，去除未結合的物質(zhì)。

多次洗滌磁珠，以去除非特異性結合的蛋白質(zhì)。

5、富集蛋白的洗脫

使用適當?shù)南疵摼彌_液洗脫與RNA結合的蛋白質(zhì)。

6、蛋白質(zhì)檢測與鑒定

SDS-PAGE電泳和銀染色以初步檢測富集到的蛋白質(zhì)。

質(zhì)譜分析或Western blotting等技術進一步鑒定所富集的蛋白質(zhì)。

7、數(shù)據(jù)分析

分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)以確定與RNA相互作用的蛋白質(zhì)種類。

對鑒定到的蛋白質(zhì)進行功能注釋和網(wǎng)絡分析，以理解RNA-蛋白質(zhì)相互作用的生物學意義。

RNA pull down實驗流程

RNA pull down常見問題

1、實驗全程需要注意什么？

實驗使用的所有試劑耗材需經(jīng)過去RNA酶處理，樣本也需要加?蛋白酶和RNA酶抑制劑，最好能夠進行超聲處理。裂解蛋白的全程盡量在冰上操作。

2、除了體外轉錄，還有別的方式獲取目的RNA嗎？

體外轉錄相比化學合成純度更高，pull-down實驗?般是體外轉錄得到目的RNA。但是當目的RNA序列大于2000bp時體外轉錄就不太容易轉錄成功，這種情況下，我們可以設計合成?小段目的RNA探針，通過探針與目的RNA結合，再與蛋白結合。

3、RNA體外轉錄濃度達到多少才能用，其OD?般都不高，可以使用嗎？如何定量呢？

通過體外轉錄得到的RNA濃度都能達到2μg/uL以上，OD值不高可進行RNA純化，即便不純化在實驗中多加?些RNA亦可。定量?般會進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以根據(jù)marker濃度來判斷RNA的濃度。也可以用儀器測量RNA的濃度。并且pull-down實驗不需要特別精確的定量，一般都會加入過量的探針。 

4、lncRNA引物設計與普通的引物設計有什么區(qū)別？

體外轉錄擴增的引物只需要在正向引物5’端加?T7啟動子序列即可。 

5、做lncRNApull down+質(zhì)譜?般都會發(fā)現(xiàn)多個互作蛋白對嗎？如何選擇哪一種蛋白繼續(xù)研究下去？

不同的RNA結合蛋白的數(shù)量不等，不能一概而論，根據(jù)自己研究的方向或相關功能確定篩選蛋白。

凝膠遷移或電泳遷移率(EMSA)

除RIP和RNA pull Down以外，凝膠遷移或電泳遷移率檢測(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)，也稱為凝膠阻滯實驗或DNA結合實驗，是一種廣泛應用于分子生物學的研究技術，也可以用于研究蛋白質(zhì)（尤其是轉錄因子）與DNA或RNA之間的相互作用。

基本原理

EMSA的基本原理是利用凝膠電泳技術來觀察蛋白質(zhì)與DNA或RNA形成復合物后遷移速率的變化。當?shù)鞍踪|(zhì)與標記的DNA或RNA片段結合后，形成的復合物比未結合的探針分子更大，因此在電泳過程中遷移速度較慢。通過比較樣品中自由探針與結合探針的比例，可以推斷出蛋白質(zhì)與核酸的結合情況。

EMSA基本原理

實驗步驟

準備樣本：提取細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)或核蛋白。

標記探針：使用放射性或非放射性標記技術標記特定的DNA或RNA序列。

蛋白質(zhì)-核酸結合：將標記的探針與待測蛋白質(zhì)混合，允許它們結合。

凝膠電泳：將混合物進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。

檢測：通過放射自顯影或其他檢測方法（如化學發(fā)光）來觀察條帶。

EMSA相關FAQ

1、三種實驗技術如何選擇？

EMSA主要用于研究RNA與蛋白質(zhì)之間的直接結合情況，比較傾向于定性分析，通常針對已知RNA研究相應蛋白，適用于初步篩選。

RIP更適合研究體內(nèi)條件下特定RNA結合蛋白與RNA的相互作用。

RNA pull-down是一種直接鑒定與特定RNA結合的蛋白質(zhì)的有效方法，適用于體外研究。

選擇哪種方法取決于您的研究目標和可用資源。例如，如果您想鑒定特定RNA結合蛋白與哪些RNA分子相互作用，那么RIP可能是更好的選擇；如果您想研究特定RNA序列與哪些蛋白質(zhì)相互作用，RNA pull-down可能是更合適的選擇。

2、為什么看不到遷移帶？

樣本中的蛋白質(zhì)含量不足；標記的探針濃度過低；標記效率低；蛋白質(zhì)失活，確保蛋白質(zhì)在處理過程中沒有變性或失活，避免反復凍融，使用新鮮制備的蛋白質(zhì)樣品。曝光或檢測時間不足；復合物不穩(wěn)定等因素。

3、實驗背景高是為什么？

蛋白的質(zhì)量不高，雜質(zhì)多；曝光或者成像時間過長；封閉時間不足洗滌效果不佳；實驗過程中膜沒有一直處于濕潤狀態(tài)；標記探針的濃度過高等因素。

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