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細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測試實(shí)驗(yàn)介紹
實(shí)驗(yàn)材料
0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
Erythosin bluish stain
取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca /Mg free saline
血球計(jì)數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometer and coverslip)
計(jì)數(shù)器(counter)
低倍倒立顯微鏡
粒子計(jì)數(shù)器(Coulter counter, Coulter Electronics)
實(shí)驗(yàn)步驟
1 取50ml 細(xì)胞懸浮液與50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等體積混合均勻于1.5ml 小離心管中。
2 取少許混合液(約15ml) 自血球計(jì)數(shù)盤chamber 上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100 倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色(或紅色- Erythrosin bluish)。
3 計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypan blue等體積混合)，后乘104 ，即為每ml 中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上，只計(jì)上線與右線之細(xì)胞(或計(jì)下線與左線之細(xì)胞)。
4 大格*細(xì)胞總數(shù)x 2 x 104 / 4= 細(xì)胞數(shù)/ml*每一大格的體積= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml
4 若不用血球計(jì)數(shù)盤，可用Coulter counter 作自動(dòng)計(jì)數(shù)，惟無法辨別死細(xì)胞或活細(xì)胞。
5 范例：T75 monolayer culture 制成10ml 細(xì)胞懸浮液，取0.1 ml 溶液與0.1ml trypan blue 混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計(jì)數(shù)盤，計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目。
活細(xì)胞數(shù)/方格：55 ,62, 49, 59
死細(xì)胞數(shù)/方格：5, 3, 4, 6
細(xì)胞總數(shù)= 243
平均細(xì)胞數(shù)/方格= 60.75
稀釋倍數(shù)= 2
細(xì)胞數(shù)/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106
細(xì)胞數(shù)/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106
存活率：225/243﹦92.6 %