一步式探針法qRT-PCR試劑盒注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

 通用原則：
1，一步式探針法qRT-PCR試劑盒先選擇好探針，然后設(shè)計引物使其盡可能的靠近于探針。
2， 擴(kuò)增子的長度應(yīng)不超過400bp，理想的能在100－150bp內(nèi)，擴(kuò)增片斷約短，有效的擴(kuò)增反應(yīng)就越容易獲得。較短的擴(kuò)增片斷也容易保證分析的一致性
3， 保持GC含量在20％和80％之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)，從而會導(dǎo)致擴(kuò)增效率的降低，及在SG分析中非特異信號。
4， 為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個連續(xù)的G）
5， 將引物和探針互相進(jìn)行配對檢測，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。
b），探針設(shè)計指導(dǎo)
1，在設(shè)計引物之前設(shè)計探針
2，探針的Tm值應(yīng)在68－70℃之間，如果是目測探針，則要仔細(xì)審查GC富含區(qū)。
3，探針的5’端要避免有鳥氨酸，5’G會有淬滅作用，即使被切割下來這種淬滅作用也還會存在
4，選擇C多于G的鏈作探針，G的含量多于C會降低反應(yīng)效率，這時就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針。
6， 探針應(yīng)盡可能的短，不要超過30個bp。
7， 檢測探針的DNA折疊和二級結(jié)構(gòu)。

產(chǎn)品名稱	一步式探針法qRT-PCR試劑盒
英文名稱	詳見說明書
編號	BJP3178

產(chǎn)品特點(diǎn)：

    全新的熱啟動DNA聚合酶-Hot Start Taq DNA聚合酶，可在PCR反應(yīng)的過程中抑制非特異擴(kuò)增，從而最大限度地減少非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生，提高熒光定量PCR反應(yīng)的特異性；
    采用新型的熒光染料EvaGreen，與傳統(tǒng)熒光染料相比，對PCR反應(yīng)抑制更小，而且熒光信號更強(qiáng)，檢測靈敏度更高；
    含有UNG的試劑盒可以防止PCR產(chǎn)物污染體系，進(jìn)而有效防止實(shí)驗(yàn)過程中PCR產(chǎn)物的交叉污染；
TaqMan熒光定量PCR試劑盒提供了除引物、探針、模板外的所有實(shí)驗(yàn)所需組分，并配備2×Buffer，可完成不同類型熒光探針的實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，方便用戶使用；
    試劑盒的通用性強(qiáng)，可適用于Roche的Light Cycler、ABI各型實(shí)時熒光定量PCR儀和。

服務(wù)流程:
1.客戶認(rèn)真寫好訂單，提供待檢基因相關(guān)信息；
2.簽訂技術(shù)服務(wù)合同，支付預(yù)付款（30-50%)；
3.設(shè)計合成定量PCR引物（或客戶提供文獻(xiàn)引物委托本公司合成）；
4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反轉(zhuǎn)錄；
5.PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)，主要檢測引物的特異性和擴(kuò)增效率；
6.正式定量實(shí)驗(yàn)：對所有樣品上機(jī)檢測；
7.實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)分析，形成報告。
原理:
所謂實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
檢測方法
1.SYBRGreenⅠ法：
在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。
SYBR定量PCR擴(kuò)增熒光曲線圖
PCR產(chǎn)物熔解曲線圖
2.TaqMan探針法：
探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成*同步。

以下是公司*產(chǎn)品：
 

β-環(huán)糊精標(biāo)準(zhǔn)品5-FAM    5-Carboxyfluorescein 5-羧基熒光素

γ-環(huán)糊精標(biāo)準(zhǔn)品5-FAM [5-Carboxyfluorescein] *Single isomer*  5-羧基熒光素（單一化合物）

環(huán)己醇標(biāo)準(zhǔn)品5-FAM [5-Carboxyfluorescein] *Single isomer*  5-羧基熒光素（單一化合物）

環(huán)硅油 4標(biāo)準(zhǔn)品5-FAM [5-Carboxyfluorescein] *Single isomer*  5-羧基熒光素（單一化合物）

環(huán)硅油 5標(biāo)準(zhǔn)品Triphenylmethyl chloride 三苯基氯烷

環(huán)硅油 6標(biāo)準(zhǔn)品rac-GR24獨(dú)角金內(nèi)酯

鹽酸環(huán)噴托酯標(biāo)準(zhǔn)品rac-GR24獨(dú)角金內(nèi)酯

環(huán)磷酰胺相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品rac-GR24獨(dú)角金內(nèi)酯

環(huán)磷酰胺相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品Thymolblue  百里香酚藍(lán)

 

環(huán)磷酰胺相關(guān)物質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品Thymolblue  百里香酚藍(lán)

黃酮哌酯相關(guān)物質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品糖原  BR，河蚌提取99%

醋酸氟卡尼標(biāo)準(zhǔn)品糖原  BR，河蚌提取99%

氟卡尼相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品糖原  BR，河蚌提取99%

5-氟-2’-脫氧脲核苷標(biāo)準(zhǔn)品糖原Ⅱ  BR，牡蠣提取

氟康唑標(biāo)準(zhǔn)品糖原Ⅱ  BR，牡蠣提取

氟康唑相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品糖原Ⅲ  BR，兔肝提取

氟康唑相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品糖原Ⅸ  BR，牛肝提取

氟康唑相關(guān)物質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品Inulin from dahlia tubers 菊糖

5-氟胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品Inulin from dahlia tubers 菊糖

磷酸氟達(dá)拉濱標(biāo)準(zhǔn)品Amylose 直鏈淀粉 （來源馬鈴薯）