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D-螢光素 (D-Luciferin) 是熒光素酶的常用底物。D-螢光素利用熒光素酶報(bào)告基因在活體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生的熒光蛋白發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生熒光，從而使用高靈敏度的光學(xué)檢測儀器檢測動(dòng)物活體體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為，普遍應(yīng)用于生物領(lǐng)域，特別是生物活體成像技術(shù)。
常見問題答疑
Q1.D-螢光素(D-luciferin)適合用于哪些實(shí)驗(yàn)?
作為螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase)的作用底物，常常用于以下實(shí)驗(yàn)：
1) 體內(nèi)活體成像In vivo imaging;熒光素酶標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞或傳染疾病通常注射入研究動(dòng)物模型比如大小鼠內(nèi)進(jìn)行研究，從而對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)時(shí)和非侵略性的監(jiān)測疾病進(jìn)程和/或藥效。
2) 體外研究In vitro study，包括熒光素酶和ATP水平分析;報(bào)告基因分析;高通量測序和各種污染檢測。
Q2.D-螢光素(D-luciferin)的作用原理如何?
作用機(jī)制:
在ATP和螢光素酶的作用下，D-螢光素（(底物>被氧化發(fā)光。當(dāng)熒光素過量時(shí)，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性(見下圖)。
機(jī)理闡釋（體內(nèi))︰
熒光素酶（Luc)催化底物D-螢光素，利用ATP和Mg2+作為輔因子，氧氣存在下發(fā)射一典型的黃綠光，之后在體內(nèi)37°C下遷移到紅光。
機(jī)理闡釋（體外)∶
很多因素都可能影響反應(yīng)靈敏性，包括溫度、pH或底物濃度。建議使用pH 7.8的緩沖液，并且使用前將所有試劑預(yù)熱到室溫。建議反應(yīng)緩沖液內(nèi)添加過量的ATP和Mg2+以達(dá)到最佳反應(yīng)狀態(tài)。
Q3.甲蟲熒光素(Beetle luciferin)和熒光蟲熒光素(Firefly luciferin)之間有差別?
兩者之間沒有差別，僅是不同公司命名上的差異，化學(xué)結(jié)構(gòu)一致。
Q4.熒光素(luciferin)如何溶解，穩(wěn)定性如何?
很多文獻(xiàn)和一些客戶提及用水溶解D-螢光素，之后置于-8OC分裝凍存，基本沒有明顯毒性效應(yīng)。鉀鹽溶解性通常是60mg/ml，而鈉鹽溶解性高達(dá)100mg/ml(游離酸不溶于水，但溶于甲醇10mg/ml或DMSO50mg/ml)。
但是，關(guān)于溶解的D-螢光素穩(wěn)定性存在爭議報(bào)道，可能由于水中含有的氧氣而破壞穩(wěn)定性。最好將D-螢光素溶于無氣水 (degassed H20)，保存效果佳。對(duì)靈敏的實(shí)驗(yàn)，然而，強(qiáng)烈建議使用新鮮配制的反應(yīng)液以降低實(shí)驗(yàn)中的可變性(比如，低濃度酶或次優(yōu)溫度或次優(yōu)鹽離子濃度可能需要高濃度底物來驅(qū)動(dòng)反應(yīng)進(jìn)行)。
Q5.D-螢光素鉀鹽和D-熒光素鈉鹽之間有差別?
兩者之間基本無差別，可能在物理特性上有些小差別，比如D-螢光素鈉鹽有點(diǎn)更顆粒狀和水溶性更由于鉀鹽。另外，從報(bào)道文獻(xiàn)來看約3倍多的文獻(xiàn)用鉀鹽，許多研究者體內(nèi)更傾向于鉀鹽，但任何一種效果一致。
Q6.D-螢光素鉀鹽/鈉鹽和D-熒光素游離酸之問有差別?
D-螢光素游離酸不溶于水，除非溶于稀堿比如NaOH或KOH調(diào)整過pH的水。溶于甲醇10mg/ml或DMSO50mg/ml。然而，D-熒光素鉀鹽或鈉鹽在實(shí)驗(yàn)中使用更方便，特別是體內(nèi)成像，由于很容易溶于水或緩沖液，對(duì)檢測系統(tǒng)的毒性更低。
Q7.為什么D-螢光素鉀鹽/鈉鹽要溶于無Ca2+或Mg2+的PBS?其他鹽溶液能用于溶解D-螢光素鉀鹽/鈉鹽?
PBS，或磷酸緩沖鹽和DPBS都是生物學(xué)研究的常用緩沖鹽，通常用于細(xì)胞相關(guān)的研究中。PBS/DPBS是等滲緩緩沖液(比如與人身體兼容)。這些緩沖液專門設(shè)計(jì)能提供和維持穩(wěn)定pH 7.2-7.6。PBS和DPBS之間沒差別，雖然后者無Ca2+/Mg2+。
鈣鎂溶液可能會(huì)限制胰酶活性。另外，Mg2+是催化D-熒光素生成氧化熒光素的關(guān)鍵成分(而Ca2+以相似的活性參與腔腸素催化)。其他鹽溶液可能用來溶解D-熒光素，只要存在的陽離子不會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果或產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。
Q8.D-螢光素在體內(nèi)如何分布?
D-螢光素注射入動(dòng)物體內(nèi)后能快速分布且很容易分散到全身。
Q9.D-螢光素的體內(nèi)發(fā)光動(dòng)力性?
D-螢光素的給藥方式很多，常用的有腹腔注射、皮下注射和靜脈注射，不同的給藥方式動(dòng)力學(xué)曲線有差異，見下圖片。對(duì)于大部分研究，腹腔/皮下注射約10-20min后達(dá)到熒光信號(hào)峰值，靜脈注射約2-5min達(dá)到信號(hào)峰值。
Q10.動(dòng)物對(duì)重復(fù)注射D-螢光素的反應(yīng)如何?
D-螢光素不會(huì)影響動(dòng)物(沒有明顯毒性或免疫反應(yīng))。
