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細(xì)胞游離DNA（cell-free DNA，cfDNA），是指在細(xì)胞外呈現(xiàn)游離狀態(tài)的DNA，在血清、血漿、腦脊液、唾液、尿液和糞便中均有發(fā)現(xiàn)。血液中cfDNA在疾病的早期篩查、診斷、預(yù)后和監(jiān)測(cè)等方面具有重要潛在價(jià)值，正逐漸成為液體活檢應(yīng)用的重要生物標(biāo)志物。由于cfDNA含量很低，健康人外周血中cfDNA濃度大部分在1-100ng/ml（在部分疾病狀態(tài)下如腫瘤、術(shù)后、病毒感染等，cfDNA水平可見(jiàn)升高）。而且由于處理方法或提取方法的差異，cfDNA樣本中可能含有較大的核酸片段比如基因組DNA的污染，這些大片段會(huì)對(duì)后續(xù)二代測(cè)序的文庫(kù)構(gòu)建產(chǎn)生負(fù)面的影響，從而導(dǎo)致測(cè)序深度降低。因此，我們需要一種既有高的靈敏度，又能夠?qū)φ麄€(gè)樣本質(zhì)量進(jìn)行全面評(píng)估的質(zhì)控方法。

對(duì)cfDNA樣本的質(zhì)控主要是評(píng)估提取得到的cfDNA的質(zhì)量、濃度及純度，有無(wú)基因組DNA的污染，以及cfDNA樣本的單核小體、雙核小體和三核小體的分布等。使用cfDNA樣本做NGS基因檢測(cè)時(shí)需要對(duì)多個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行質(zhì)控以確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性，因此不排除偶爾會(huì)出現(xiàn)cfDNA產(chǎn)量不足從而導(dǎo)致樣本測(cè)序失敗的情況。

LabChip® GX TouchTM 微流控核酸分析儀基于PerkinElmer微流控芯片技術(shù)，提供全面、高質(zhì)量的NGS質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)。它以蝕刻芯片為載體，整合上樣、分離、檢測(cè)、清洗等過(guò)程，在納升體系內(nèi)對(duì)DNA或RNA樣品進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、高重復(fù)性的定性和定量分析。只需一步設(shè)置，即可完成全天多個(gè)批次樣品分析，可實(shí)現(xiàn)相當(dāng)高程度的自動(dòng)化與標(biāo)準(zhǔn)化。

圖1. LabChip® GX TouchTM微流控核酸分析儀

最新問(wèn)世的cfDNA檢測(cè)試劑，專為cfDNA質(zhì)控應(yīng)用而開(kāi)發(fā)，更將其檢測(cè)靈敏度、定量準(zhǔn)確性推上了高度。

cfDNA assay優(yōu)化體現(xiàn)在哪里？

cfDNA樣本通常在LabChip® GX TouchTM微流控核酸分析儀或其他系統(tǒng)上進(jìn)行質(zhì)控分析，但存在一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題是，提取樣本中的鹽以及其他有機(jī)或生物成分的殘留可能導(dǎo)致高分子量?jī)?nèi)標(biāo)信號(hào)下降或高分子量?jī)?nèi)標(biāo)峰消失，進(jìn)而導(dǎo)致cfDNA定量和片段大小測(cè)定不準(zhǔn)確。為解決此問(wèn)題，我們引入50bp的DNA片段作為內(nèi)標(biāo)，用于cfDNA定量。我們還優(yōu)化了凝膠篩分基質(zhì)，可以最快的檢測(cè)速度和最高靈敏度，實(shí)現(xiàn)單、雙核小體cfDNA的基線分離。cfDNA assay的濃度定量準(zhǔn)確度和精確度與市售競(jìng)品方法相當(dāng)或更優(yōu)。此外，LabChip cfDNA assay被證明可用于分析使用多種市售提取試劑盒制備的cfDNA樣本。

LabChip cfDNA assay的濃度檢測(cè)線性范圍為5-100pg/μL，可檢測(cè)樣品板中濃度低至2.5pg/μL (S/N>3) 的cfDNA樣本。定量準(zhǔn)確度在目標(biāo)濃度的±20%以內(nèi)，片段大小準(zhǔn)確度在目標(biāo)片段大小的±10%以內(nèi)。LabChip cfDNA assay是一種可靠的高通量、自動(dòng)化、易用型檢測(cè)方法，可在1.5小時(shí)內(nèi)對(duì)一次芯片制備中多達(dá)96個(gè)cfDNA樣本的濃度和片段大小進(jìn)行量化檢測(cè)，并提供cfDNA樣本中污染物的定性信息。

圖2. cfDNA實(shí)驗(yàn)的LOD和線性測(cè)試 A）連續(xù)稀釋液中cfDNA樣本（起始濃度為50-1000pg/μL）定量結(jié)果：電泳圖所示為連續(xù)稀釋樣本的cfDNA彌散條帶分布；B）參比方法（競(jìng)品方法A）測(cè)得單核小體cfDNA濃度與LabChip® GX TouchTM測(cè)得濃度的關(guān)系圖。

該檢測(cè)方法與cfDNA提取工作流程的兼容性

我們使用三種市售cfDNA提取試劑盒（PerkinElmer chemagic cfDNA 1.5k Kit, QIAamp® Circulating Nucleic Acid Kit, ThermoFisher MagMAX® Cell-Free DNA Isolation Kit），按照制造商推薦方案（使用不同血漿量）提取cfDNA樣本。用所需體積的TE緩沖液稀釋所提取的樣本，使之歸一化為每毫升血漿起始量。采用LabChip cfDNA assay對(duì)樣本進(jìn)行分析，結(jié)果列于圖3和表1中。從數(shù)據(jù)中可以看出，LabChip cfDNA實(shí)驗(yàn)的定量和片段大小檢測(cè)不受cfDNA提取殘留物的影響，無(wú)論使用何種提取試劑盒進(jìn)行提取，均可用于分析cfDNA樣本。

圖3: 使用chemagic 360、Qiagen和Magmax提取試劑盒提取的cfDNA樣本的疊加電泳圖

表1: cfDNA檢測(cè)的采用不同提取試劑盒提取的樣本單核小體cfDNA濃度（歸一化為每毫升血漿起始量）

cfDNA檢測(cè)所需耗材

*LabChip DNA X-Mark芯片單獨(dú)出售

LabChip GX Touch系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)

隨著cfDNA assay的推出，LabChip GX Touch真正成為了All-in-One的樣本質(zhì)控利器：

采用業(yè)內(nèi)金標(biāo)準(zhǔn)的微流控芯片技術(shù)，簡(jiǎn)化凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中的繁瑣操作步驟

10種Assay，提供全面NGS質(zhì)控

? 起始樣品：基因組DNA、cfDNA、RNA、mRNA、small RNA

? 建庫(kù)流程：接頭去除、片段選擇、擴(kuò)增效率

? 文庫(kù)

• 片段大小范圍：25bp-12kb

• smear檢測(cè)靈敏度：2.5pg/µL

• 定量準(zhǔn)確性堪比熒光方法

• 同時(shí)提供片段大小分布信息

提供基因組DNA質(zhì)量評(píng)分（GQS，也稱為DQS）和RNA質(zhì)量評(píng)分（RQS）

LabChip GX Touch可用于NGS和生物樣本庫(kù)的樣本質(zhì)量評(píng)價(jià)，而且這兩項(xiàng)質(zhì)量評(píng)分被收錄于兩項(xiàng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：“高通量測(cè)序的核酸類樣本質(zhì)量控制通用要求GB/T 40664—2021"，以及“生物樣本庫(kù)核酸樣本質(zhì)量評(píng)價(jià)方法GB/T 40974—2021"。

樣本上樣量少：150nl足矣

自動(dòng)化快速檢測(cè)

• 可快至28s/樣品，實(shí)時(shí)獲得定性定量數(shù)據(jù)

• 無(wú)需手動(dòng)上樣、人工chip prime

靈活的通量選擇——1-24乃至1-384樣品/輪

具備醫(yī)療器械備案注冊(cè)證（一類）

真正“用得起"的平臺(tái)——芯片可重復(fù)使用