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描述：BCA 蛋白質定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)是根 據目前世界上常用的蛋白濃度檢測方法之一－BCA （bicinchoninic acid）法改良研制而成，該試劑盒具有蛋白 濃度測定的簡單性，高穩(wěn)定性，高靈敏度和高兼容性。本試 劑盒的原理是蛋白質分子中的肽鍵結構在堿性環(huán)境下能與 Cu2+絡合生成絡合物，將 Cu2+還原成 Cu+，而 BCA 試劑可 敏感特異地與 Cu+結合，形成穩(wěn)定的有顏色的復合物，并在 562nm 處有最大光吸收值，該復合物顏色深淺與蛋白質濃度 成正比，可根據吸收值的大小來測定蛋白的含量，1 小時內 即可完成蛋白定量檢測。本試劑盒含有牛血清白蛋白（BSA） 溶液作為蛋白質標準溶液，測定范圍為 25～2000 μg/ml。該 試劑盒可用于 20 次試管檢測或 200 次 ELISA 板檢測。

操作方法
1. 標準品的稀釋：按下表將 BSA 進行稀釋。
管號 PBS
BSA 體積
（來源）
BSA 終濃度
（μg/ml）
A 0 300 μl (母液) 2000
B 125 μl 375 μl (母液) 1500
C 325 μl 325 μl (母液) 1000
D 175 μl 175 μl (B 管) 750
E 325 μl 325 μl (C 管) 500
F 325 μl 325 μl (E 管) 250
G 325 μl 325 μl (F 管) 125
H 400 μl 100 μl (G 管) 25
I 400 μl 0 0
2. BCA 工作液的配置：根據樣品數量及測定方法，將 BCA Reagent A 和 BCA Reagent B 按體積比 50:1充分混勻即可。
注意：配制 BCA 工作液前請將 BCA Reagent A 混勻。
3. 標準比色杯測定方法
(1)吸取 0.1 ml 的各標準品和待測樣品置于合適的管中。
(2)加入 2 ml BCA 工作液，充分混勻。
(3)37℃孵育 30 min，然后室溫靜置 10 min。
(4)紫外分光光度計于 562 nm 處檢測吸光度。
(5)繪制標準曲線。
(6)根據標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。
4. 微管測定方法
(1)分別取 25 μl 新鮮配制的 BSA 標準液和待測樣品，加入到 ELISA 反應板中。
(2)每孔加入 200 μl BCA 工作液，充分混勻。
(3)37℃孵育 30 min，然后室溫靜置 10 min。
(4)酶標儀于 562nm 處檢測吸光度。
(5)繪制標準曲線。
(6)根據標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。
注意事項
1. 待測樣品濃度在 25~2000 μg/ml 的范圍內具有良好的線性關系。
2. BCA 工作液配制后 24 小時內使用效果穩(wěn)定。
3. BCA 法測定蛋白濃度時，吸光度會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反應會因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或延長孵育時間。
4. 使用普通的分光光度計測定時，需根據比色皿的最小檢測體積，適當加大 BCA 工作液的用量，使其不小于最小檢測體積，樣品和標準品的用量可相應按比例調整。
5. 適用范圍

實例操作 按上述操作方法可得到如下標準工作曲線，該線性方程經過 多次繪制，系數均為 0.0001，且 R 2 值均在 0.99~1 之間， 重復性好，在計算蛋白濃度時可直接用該標準工作曲線進行 計算。例如：在 562 nm 處檢測吸光值為 0.1，則此時 y 值 為 0.1，代入方程 y=0.0001x 中，可得蛋白濃度為 1000 μg/ml。

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是，只有在有序齊全的基礎上，才能進行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間，可根據待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數:

其他參數選定后，PCR循環(huán)次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數。循環(huán)次數越多，非特異擴增增加。

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