蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾（NH2-PEG-MAL NHS-PEG-SH）
蛋白質(zhì)的PEG修飾主要包括：蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈基團(tuán)的改變和蛋白質(zhì)分子中主鏈結(jié)構(gòu)的改變二個(gè)方向。關(guān)于側(cè)鏈基團(tuán)修飾的研究較多。化學(xué)修飾反應(yīng)的活性和選擇性主要由蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)活性及修飾劑的反應(yīng)活性決定[5]。其中蛋白質(zhì)功能基的活性由微區(qū)極性和空阻效應(yīng)決定。修飾劑的反應(yīng)活性主要取決于修飾劑分子中官能團(tuán)的類(lèi)型。
我們可以用于蛋白修飾的PEG有化學(xué)法修飾方法，目前常用的有三種基團(tuán)修飾，PEG修飾的基團(tuán)主要是氨基如（MAL-PEG-NH2）、巰基如（HS-PEG-COOH）、羧基如（COOH-PEG-OH）等。下面我們主要介紹這三種修飾方法：
方法1：氨基法修飾蛋白(NH2-PEG)
可能用的到的產(chǎn)品：
NH2-PEG-COOH
NH2-PEG-MAL
NH2-PEG-N3
NH2-PEG-Alkyne
NH2-PEG-SH
NH2-PEG-Biotin
NH2-PEG-OPSS
NH2-PEG-OH
蛋白質(zhì)分子表面的游離氨基(主要為L(zhǎng)ys殘基側(cè)鏈的氨基)具有較高的親核反應(yīng)活性。因此Lys殘基的氨基成為方便,常用的被修飾基團(tuán)。PEG的分子量大多為5kD。目前常用的活化劑有氰尿酰氯(亦稱(chēng)三聚氯氰)(見(jiàn)圖1)和N-羥基琥珀酰亞胺(見(jiàn)圖2)。
(1)氰尿酰氯法特點(diǎn)是試劑易得、活化簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短、方便經(jīng)濟(jì)。但其對(duì)有些酶(例如:SOD)的活性有影響。這種活化中間物有兩種形式:一種是一分子氰尿酰氯與一分子PEG偶聯(lián)(PEG1);另一種是一分子氰尿酞氯與兩分子PEG偶聯(lián)(PEG2)。通常PEG2修飾的蛋白質(zhì)效果要更好。它可以在較低的修飾程度下獲得解除免疫原性產(chǎn)物,而且生物活性保留明顯高于PEG1修飾的產(chǎn)物。(2)在pH=7～ 9條件下,PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯類(lèi)化合物可以直接修飾殘基上的氨基。將PEG上的羥基轉(zhuǎn)化為羧基,其中常用的是通過(guò)羥基與琥珀酸酐反應(yīng),
所得衍生物化合物為PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯[6]。此外,N-末端氨基修飾也是一種常用的修飾方法。蛋白質(zhì)N端氨基的pKa(7.6～8.0),小于蛋白質(zhì)其他部位的氨基(如賴(lài)氨酸的pKa為10.0～10.2)。因此,在較低pH值(如pH 5.0)溶液中,PEG-醛主要與N-端氨基反應(yīng)生產(chǎn)希夫堿,后被還原為仲胺。
方法2：巰基修飾（PEG-SH/Thiol）
可能用的到的產(chǎn)品：
HS-PEG-NHS
Biotin-PEG-SH
CHO-PEG-SH
Hydrazide-PEG-SH
Silane-peg-SH
Acrylates-peg-SH
Lipoicacid-peg-SH
Tosylate-peg-SH
蛋白質(zhì)上的修飾基團(tuán)多為親核性的,其活性的順序是:巰基>α -氨基>ε -氨基>羥基。所以可以選取能夠特異性PEG修飾劑對(duì)數(shù)目巰基進(jìn)行定向修飾。此類(lèi)PEG修飾劑主要有:
(1)PEG-馬來(lái)酰亞胺(PEG-maleimide)
NHS-PEG-MAL
N3-PEG-MAL
Alkyne-PEG-MAL
Biotin-PEG-MAL
CHO-PEG-MAL
OPSS-PEG-MAL
(2) P E G- 鄰- 吡啶- 二硫醚( P E G -ortho-pyr idyl-disulphide) ;
Hydrazide-PEG-OPSS
Silane-peg-OPSS
Acrylates-peg-OPSS
Lipoic acid-peg-OPSS
Tosylate-peg-OPSS
Acetylthio-peg-OPSS
Aminooxy-PEG-OPSS
NPC-PEG-OPSS
SAS-PEG-OPSS
SC-PEG-OPSS
SCM-PEG-OPSS
SG-PEG-OPSS
SS-PEG-OPSS
(3)PEG-乙烯基砜(PEG-vinyl sulfone);
(4)PEG-碘乙酰胺(PEG-idoacetamide)。
其中,PEG-馬來(lái)酰亞胺應(yīng)用較多。但產(chǎn)物在水中不夠穩(wěn)定,容易發(fā)生開(kāi)環(huán)反應(yīng)。Winslow[7]等在PEG與馬來(lái)酰亞胺之間添加芳香環(huán)作連接基團(tuán),并用來(lái)修飾血紅蛋白質(zhì),取得了更佳的修飾專(zhuān)一性。對(duì)于缺少巰基的蛋白質(zhì),可以通過(guò)基因工程在蛋白質(zhì)的合適位置引入巰基,再用相應(yīng)PEG進(jìn)行修飾。常用的引入位置有糖基化蛋白質(zhì)的糖基化位置、蛋白質(zhì)的抗原決定簇和蛋白質(zhì)末端等。此外,還可用Traut試劑處理蛋白質(zhì)引入巰基。此方法方便可靠,目前應(yīng)用為廣泛。但缺點(diǎn)是半胱氨酸在蛋白質(zhì)內(nèi)多為重要活性基團(tuán)。因此這樣修飾有可能影響活性。
方法3：羧基的修飾
把PEG分子中的羥基轉(zhuǎn)化為氨基,然后在羧二亞胺存在下與蛋白質(zhì)的羧基縮合,得到修飾的蛋白質(zhì)(見(jiàn)圖4)。對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾時(shí),關(guān)鍵是修飾劑的選擇和修飾路線的確定。修飾路線的確定,要考慮使修飾蛋白質(zhì)能大限度地保留原來(lái)生物活性,要能使其免疫原性降至小程度,甚至*解除,其中修飾度的確定非常重要。修飾劑的選擇要考慮其結(jié)構(gòu)與性質(zhì),還要考慮其分子量大小。所以這兩方面的選擇是很重要的。
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DBCO-PEG-NH2
TCO-PEG-NH2
Tetrazine-PEG-NH2
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