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            肽是怎么合成的?

            閱讀:1186      發(fā)布時(shí)間:2024-8-6
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            在有機(jī)化學(xué)中,肽合成是肽的產(chǎn)生,肽是其中多個(gè)氨基酸通過肽鍵(也稱為酰胺鍵)結(jié)合的有機(jī)化合物。

            內(nèi)容

             

            1.化學(xué)
            2.液相合成
            3.固相合成
            3.1.中國(guó)銀行SPPS
            3.2.Fmoc SPPS
            4.固體支持物
            4.1.聚苯乙烯樹脂
            4.2.聚酰胺樹脂
            5.保護(hù)團(tuán)體
            5.1.Fmoc保護(hù)基團(tuán)
            5.2.Boc保護(hù)基團(tuán)
            5.3.芐氧羰基(Z)基團(tuán)
            5.4.Alloc保護(hù)基團(tuán)
            5.5.平版保護(hù)基團(tuán)
            6.激活組
            6.1.碳化二亞胺
            6.2.芳香肟
            7.合成長(zhǎng)肽
            8.固相肽合成的一個(gè)例子
            9.參考

            1.化學(xué)

             

            肽是通過將一個(gè)氨基酸的羧基或C端偶聯(lián)到另一個(gè)氨基酸的氨基或N端而合成的。

            2.液相合成

             

            液相肽合成是肽合成的經(jīng)典方法。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中,它已被固相合成所取代(見下文)。然而,它在用于工業(yè)目的的肽的大規(guī)模生產(chǎn)中仍然有用。

            3.固相合成

             

            Merrifield固相肽合成(SPPS)導(dǎo)致了肽合成領(lǐng)域的范式轉(zhuǎn)變。這是目前實(shí)驗(yàn)室以合成方式制造肽和蛋白質(zhì)的方法。SPPS允許合成難以在細(xì)菌中表達(dá)的天然肽、摻入非天然氨基酸、肽/蛋白質(zhì)骨架修飾以及合成由D-氨基酸組成的D-蛋白質(zhì)。


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                                   固相肽合成(SPPS)原理

            小珠子用接頭處理,在接頭上可以構(gòu)建肽鏈。合成珠將保持與肽的強(qiáng)結(jié)合,直到被試劑裂解。珠子創(chuàng)造了一種合成環(huán)境,在這種環(huán)境中,產(chǎn)生的肽鏈不會(huì)通過過濾材料,而用于產(chǎn)生肽鏈的試劑會(huì)通過。

             

            重點(diǎn)考慮在每一步中產(chǎn)生高的產(chǎn)量。例如,如果每個(gè)步驟具有99%的產(chǎn)率,26個(gè)氨基酸的肽將以77%的最終產(chǎn)率合成,如果每個(gè)步驟是95%,它將以25%的產(chǎn)率合成。因此,每一種氨基酸都是以大大過量(2 ~ 10倍)添加的,并且通過一系列充分表征的試劑將氨基酸偶聯(lián)在一起是高度優(yōu)化的

             

            有兩種主要的SPPS形式——Fmoc和Boc。與核糖體蛋白質(zhì)合成不同,固相肽合成以C-末端到N-末端的方式進(jìn)行。氨基酸單體的N-末端被這兩個(gè)基團(tuán)保護(hù),并被加到去保護(hù)的氨基酸鏈上。

             

            自動(dòng)合成器可用于這兩種技術(shù),盡管許多研究小組繼續(xù)手動(dòng)執(zhí)行spp。

             

            SPPS受到產(chǎn)量的限制,通常70~100個(gè)氨基酸范圍內(nèi)的肽和蛋白質(zhì)正在推動(dòng)合成可及性的極限。合成難度也依賴于序列;典型的淀粉樣肽和蛋白質(zhì)很難制造。通過使用天然化學(xué)連接將兩個(gè)肽偶聯(lián)在一起,可以獲得更長(zhǎng)的長(zhǎng)度,并具有定量的產(chǎn)量。

            3.1.中國(guó)銀行SPPS

             

            當(dāng)R. B. Merrifield在1963年發(fā)明SPPS時(shí),它是根據(jù)tBoc方法。t-Boc(或Boc)代表叔丁氧羰基。為了從生長(zhǎng)的肽鏈上去除Boc,使用酸性條件(通常是純TFA)。在合成結(jié)束時(shí),通過在氫氟酸中孵育(這可能是危險(xiǎn)的),從樹脂中除去側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)和肽;由于這個(gè)原因,Boc化學(xué)通常不受歡迎。然而,對(duì)于復(fù)雜的合成,Boc是有利的。當(dāng)合成對(duì)堿基敏感的非天然肽類似物(如depsi肽)時(shí),Boc是必需的。

            3.2.Fmoc SPPS

             

            4.固體支持物                        

             

            固相支持物的物理性質(zhì)及其可用于的應(yīng)用,隨著構(gòu)建支持物的材料、交聯(lián)的量以及所用的接頭和手柄而變化。

            4.1.聚苯乙烯樹脂

             

            這是一種多功能樹脂,由于其在DCM中的溶脹最小,因此在多孔自動(dòng)化肽合成中非常有用。

            4.2.聚酰胺樹脂

             

            這也是一種有用和多用途的樹脂。它似乎比聚苯乙烯膨脹得多,在這種情況下,如果孔太小,它可能不適合一些自動(dòng)合成器。

            5.保護(hù)團(tuán)體

             

            由于在每個(gè)合成步驟中使用過量的氨基酸來確保偶聯(lián),在每個(gè)氨基酸未被保護(hù)的反應(yīng)中,氨基酸的聚合是常見的。為了防止這種聚合,使用了保護(hù)基團(tuán)。這給合成反應(yīng)增加了額外的去保護(hù)階段,產(chǎn)生了如下的重復(fù)設(shè)計(jì)流程:

             

            • 在去保護(hù)反應(yīng)中,保護(hù)基團(tuán)從尾部氨基酸中被除去

            • 洗去脫保護(hù)試劑以提供清潔的偶聯(lián)環(huán)境

            • 溶解在溶劑如二甲基甲酰胺(DMF)中的受保護(hù)的氨基酸與偶聯(lián)劑混合,泵送通過合成柱

            • 洗去偶聯(lián)試劑以提供干凈的去保護(hù)環(huán)境

             

            目前,固相肽合成中通常使用兩種保護(hù)基團(tuán)(Fmoc,Boc)。它們的不穩(wěn)定性是由氨基甲酸酯基團(tuán)引起的,氨基甲酸酯基團(tuán)容易釋放CO2用于不可逆的解偶聯(lián)步驟。

            5.1.Fmoc保護(hù)基團(tuán)

             

            Fmoc(9-芴基甲基氨基甲酸酯)是目前廣泛使用的保護(hù)基團(tuán),其通常在從氨基酸單元重復(fù)合成肽的過程中從肽的N末端除去。Fmoc的優(yōu)點(diǎn)是它在非常溫和的堿性條件下(例如哌啶)被裂解,但在酸性條件下穩(wěn)定。這使得在堿性條件下穩(wěn)定的溫和的酸不穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán),例如Boc和芐基,被用于目標(biāo)肽的氨基酸殘基的側(cè)鏈上。這種正交保護(hù)基策略在有機(jī)合成領(lǐng)域很常見。

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            5.2.Boc保護(hù)基團(tuán)

             

            在Fmoc基團(tuán)流行之前,Boc基團(tuán)通常用于保護(hù)肽的末端胺,需要在正交策略中使用更多酸穩(wěn)定的基團(tuán)用于側(cè)鏈保護(hù)。它保留了在合成過程中減少肽聚集的作用。Boc基團(tuán)可以用boc酸酐和合適的堿加成到氨基酸上。

            image.png


            5.3.芐氧羰基(Z)基團(tuán)

             

            另一種基于氨基甲酸酯的基團(tuán)是芐氧羰基(Z)基團(tuán)。它在更苛刻的條件下被去除:溴化氫/乙酸或催化氫化。今天,它幾乎用于側(cè)鏈保護(hù)。

            5.4.Alloc保護(hù)基團(tuán)

             

            當(dāng)需要鄰位去保護(hù)方案時(shí),烯丙氧基羰基(alloc)保護(hù)基團(tuán)通常用于保護(hù)羧酸、羥基或氨基。有時(shí)在進(jìn)行樹脂上環(huán)肽形成時(shí)使用,其中肽通過側(cè)鏈官能團(tuán)與樹脂連接。可以使用四(三苯基膦)鈀(0)以及氯仿、乙酸和N-甲基嗎啉(NMM)的37∶2∶1混合物2小時(shí)來除去alloc基團(tuán)。然后,必須用0.5 % DIPEA的DMF溶液、3×10ml 0.5%二乙基硫代氨基甲酸鈉的DMF溶液以及5×10ml 1:1 DCM:DMF溶液仔細(xì)清洗樹脂。

            5.5.平版保護(hù)基團(tuán)

             

            對(duì)于特殊應(yīng)用,如蛋白質(zhì)微陣列,使用平版印刷保護(hù)基團(tuán)。這些基團(tuán)可以通過曝光去除。

            6.激活組

             

            為了偶聯(lián)肽,羧基通常被活化。這對(duì)加速反應(yīng)很重要。有兩種主要類型的活化基團(tuán):碳二亞胺和芳香肟。

            6.1.碳化二亞胺

             

            這些活化劑最初是被開發(fā)出來的。最常見的是二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和二異丙基碳二亞胺(DIC)。與羧酸反應(yīng)生成高活性的O-酰基脲。在人工蛋白質(zhì)合成過程中(如Fmoc固態(tài)合成儀),C末端通常用作氨基酸單體添加的附著位點(diǎn)。為了增強(qiáng)羧酸基團(tuán)的親電性,帶負(fù)電荷的氧必須首先被“活化"成更好的離去基團(tuán)。DCC用于此目的。帶負(fù)電荷的氧將充當(dāng)親核試劑,攻擊DCC中的中心碳。DCC暫時(shí)連接到以前的羧酸酯基團(tuán)(現(xiàn)在是酯基團(tuán)),使得氨基(在連接的氨基酸上)對(duì)以前的C-末端(碳?;?的親核攻擊更有效。碳二亞胺的問題是它們反應(yīng)性太強(qiáng),因此會(huì)導(dǎo)致氨基酸的外消旋化。

            image.png

            6.2.芳香肟

             

            為了解決外消旋化的問題,引入了芳香肟。最重要的是1-羥基-苯并三唑(HOBt)和1-羥基-7-氮雜-苯并三唑(HOAt)。


            image.png

            其他的已經(jīng)開發(fā)出來了。這些物質(zhì)可以與O-?;宸磻?yīng)生成活性酯,該活性酯的活性較低,外消旋化的危險(xiǎn)也較小。由于鄰群效應(yīng),HOAt特別有利。[1]


            image.png


            最新的發(fā)展省略了碳二亞胺。活性酯作為非親核陰離子(四氟硼酸鹽或六氟磷酸鹽)的脲鹽或鏻鹽引入:HBTU、HATU、PyBOP。

            7.合成長(zhǎng)肽

             

            逐步延伸,其中氨基酸逐步依次連接,對(duì)于含有2至100個(gè)氨基酸殘基的小肽是理想的。另一種方法是片段縮合,其中肽片段被偶聯(lián)。雖然前者可以延長(zhǎng)肽鏈而不發(fā)生外消旋化,但如果僅用于產(chǎn)生長(zhǎng)肽或高極性肽,產(chǎn)量會(huì)下降。對(duì)于合成復(fù)雜的長(zhǎng)肽來說,片段縮合比逐步延伸更好,但是為了防止外消旋化,必須限制它的使用。片段縮合也是不希望的,因?yàn)榕悸?lián)的片段必須大大過量,這可能是一個(gè)取決于片段長(zhǎng)度的限制。

             

            產(chǎn)生更長(zhǎng)肽鏈的一個(gè)新進(jìn)展是化學(xué)連接:未保護(hù)的肽鏈在水溶液中發(fā)生化學(xué)選擇性反應(yīng)。第一個(gè)動(dòng)力學(xué)控制的產(chǎn)物重排形成酰胺鍵。最常見的天然化學(xué)連接形式使用與末端半胱氨酸殘基反應(yīng)的肽硫酯。

            8.固相肽合成的一個(gè)例子

             

            以下是使用堿不穩(wěn)定的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保護(hù)基團(tuán)在聚酰胺或聚苯乙烯樹脂上合成肽的合成步驟的概述。使用下面概述的技術(shù),將獲得在N-末端用乙?;舛?,在C-末端用伯酰胺(CONH2)封端的肽。

             

            為手動(dòng)肽合成設(shè)置玻璃器皿

             

            手動(dòng)肽合成可以在具有三通閥的燒結(jié)過濾器反應(yīng)容器中完成,該三通閥通過1孔塞子安裝在1 L側(cè)臂真空燒瓶上。一個(gè)閥門用于充入氮?dú)猓獨(dú)馐紫韧ㄟ^一個(gè)小的Drierite柱,然后進(jìn)入反應(yīng)混合物以攪拌溶液和混合試劑。另一個(gè)閥門用于排空過量的反應(yīng)溶液,并使用真空瓶洗滌溶劑。用于固相合成的所有玻璃片應(yīng)在使用前用硅烷化試劑(如DCM中的1-5%二甲基二氯硅烷)處理,以避免靜電荷的積累,靜電荷的積累會(huì)使樹脂很難處理。

             

            聚酰胺樹脂的制備

             

            聚酰胺(PL-DMA)樹脂(1g)用乙二胺(40 ml)在50 ml Falcon管中在搖床上處理過夜,然后過濾,用5×10ml 1:1二甲基甲酰胺(DMF):二氯甲烷(DCM)溶液、5×10ml 1:1 DCM洗滌,并使用苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷六氟磷酸鹽(PyBOP) (3 eq)、1-羥基苯并三唑水合物(HOBt) (3 eq)和二異丙基乙胺(DIPEA)裝載Fmoc-Rink然后可以在真空下干燥,并儲(chǔ)存在-15攝氏度,直到需要。

             

            在合成前和合成過程中處理樹脂

             

            樹脂首先在10毫升1∶1 DCM∶DMF中溶脹15分鐘,然后瀝干。每次完成氨基酸偶聯(lián)后,還用5×10ml 1:1 DCM和DMF洗滌樹脂。

             

            Fmoc-去保護(hù)

            每次氨基酸偶聯(lián)后,用2×10ml 20%哌啶的DMF溶液進(jìn)行Fmoc去保護(hù),每次處理用N2攪拌10分鐘。然后用5×10毫升DMF洗滌樹脂,接著用5×10毫升1:1 DCM:DMF洗滌。

             

            添加氨基酸

             

            為了在Fmoc-聚酰胺-Rink樹脂上開始肽合成,通過用哌啶處理樹脂來除去Fmoc基團(tuán)。然后使用在1∶1 DCM∶DMF中的PyBOP (3 eq)、HOBt (3 eq)和DIPEA (6 eq)將第一個(gè)氨基酸偶聯(lián)至樹脂的Fmoc-去保護(hù)的N-末端胺,或之前偶聯(lián)的氨基酸,直到樹脂對(duì)茚三酮呈陰性。

             

            監(jiān)測(cè)氨基酸偶聯(lián)的進(jìn)展

             

            氨基酸偶聯(lián)的過程可以用茚三酮或?qū)β弱珌砀櫋\崛芤涸谟坞x伯胺的存在下變成深藍(lán)色(陽(yáng)性結(jié)果),但在其他情況下是無色的(陰性結(jié)果)。如果使用乙醛作為溶劑,在伯胺的存在下,或者如果使用丙酮,在仲胺的存在下,對(duì)-氯醌溶液將使樹脂珠變成深黑色或藍(lán)色;否則珠子保持無色或淡黃色。(測(cè)試概述如下)

             

            茚三酮測(cè)試(1)

             

            向微量離心管中加入2滴40%苯酚的乙醇溶液、2滴0.014 M KCN的吡啶溶液和4滴5%茚三酮的乙醇溶液,以及抹刀一端大小的樹脂樣品,然后渦旋混合物,并在100°c下加熱5分鐘

             

            用氯醌測(cè)試(2)

             

            向微量離心管中加入5滴丙酮或乙醛、5滴對(duì)氯醌的甲苯飽和溶液,以及小刮刀一端大小的樹脂樣品,然后渦旋混合物,并在室溫下靜置5分鐘。丙酮用于檢測(cè)仲胺,乙醛用于檢測(cè)伯胺。

             

            持續(xù)肽延伸

             

            一旦氨基酸的偶聯(lián)完成,就洗滌樹脂,用哌啶去保護(hù)Fmoc基團(tuán),并再次洗滌樹脂,為下一次偶聯(lián)做準(zhǔn)備。重復(fù)這一過程,直到添加完所有必需的氨基酸。

             

            乙?;疦-末端

             

            肽序列完成后,可以用2ml 1:1乙酸酐和三乙胺在10ml 1:1 DCM:DMF中乙?;疦-末端胺1小時(shí)或直到茚三酮陰性,然后用5×10ml 1:1 DCM:DMF洗滌樹脂,然后將肽從樹脂上切下。如果需要,N-末端也可以作為游離胺留下。

             

            從樹脂上切割肽

             

            用3×10ml 96∶2∶2的TFA、三異丙基硅烷(TIPS)和水(H2O)處理樹脂,每次處理10分鐘,然后過濾掉樹脂,將合并的濾液靜置1小時(shí),以確保除去酸不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)。

             

            從樹脂上切割后肽的處理

             

            將TFA在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干(或重油或玻璃,如果它不凝固的話),隨后向燒瓶中加入5 ml*醚以沉淀肽,并除去大部分副產(chǎn)物。將肽和乙*的懸浮混合物加入到50 ml Falcon管中,并以3000 rpm的速度旋轉(zhuǎn)10-20分鐘(IEC離心機(jī)),直到可以倒出乙*而不損失任何肽。加入更多的后,通過渦旋使肽重新懸浮。再次離心混合物,倒出,洗滌過程重復(fù)兩次以上。最后,產(chǎn)品可以在脫粘器中的Falcon管中風(fēng)干過夜。

            通常使用制備型HPLC來純化最終產(chǎn)物。獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)以確保獲得目標(biāo)肽。



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