實(shí)驗(yàn)步驟

1. 樣品準(zhǔn)備

a. 細(xì)胞上清樣品，需將培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞消化離心取上清即可（如800g，5分鐘）。

b. 血清樣品，將全血收集至不含抗凝劑的試管內(nèi)，在室溫下放置1小時(shí)，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1500g離心10分鐘，取黃色上清即得血清。

c. 血漿樣品，將全血收集至含抗凝劑的試管內(nèi)，混勻后置冰上，4℃約1500g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿。

2. 確定樣品測試組、標(biāo)準(zhǔn)品和空白組組所需的微孔條數(shù)量，每個(gè)濃度做兩個(gè)平行重復(fù)，從支架上取出對應(yīng)數(shù)量的微孔條，剩余儲(chǔ)存在箔袋中，密封后在4℃儲(chǔ)存。

3. 配制對應(yīng)濃度的捕獲抗體溶液、檢測抗體溶液、包被液、洗滌液、樣品稀釋液、顯色液、終止液、鏈霉親和素-HRP（若使用試劑盒則沒有此步驟或按試劑盒要求配制）。

4. 每孔加入100μL 捕獲抗體溶液，用封板膜覆蓋，4℃孵育過夜，過夜后舍棄舍板內(nèi)溶液。

5. 每孔加入300-400μL洗滌液清洗五次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干（若使用試劑盒則沒有步驟4和5）。

6. 用樣品稀釋液按照1:5, 1:10, 1:50, 1:100, 1:1000, 1:2000稀釋樣品，以此確定樣品IL-2的最佳檢測濃度。

7. 配制梯度濃度的IL-2蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，將工作濃度設(shè)置為1200pg/mL, 600pg/mL, 300pg/mL, 150pg/mL, 75pg/mL, 37.5pg/mL, 18.75pg/mL，9.38pg/mL，以此濃度來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

8. 分別將樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液按照100μL/孔加入相應(yīng)孔中作為標(biāo)測試組、標(biāo)準(zhǔn)品組、空白組。

9. 將偶聯(lián)sws的抗人IL-2抗體按照50μL/孔加入所有孔中，用封板膜覆蓋，室溫避光孵育2小時(shí)。

10. 每孔加入300-400μL洗滌液洗板五次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。

11. 在所有孔加入100μL稀釋后的鏈霉親和素-HRP，用封板膜覆蓋，室溫避光孵育1小時(shí)。

12. 每孔加入300-400μL洗滌液洗板五次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。

13. 在所有孔中加入100μL TMB顯色液。用封板膜覆蓋，室溫避光孵育30min。

14. 在所有孔中加入終止液50μL，混勻后立即測量A450值。

15. 計(jì)算每一組重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的平均吸光度值。重復(fù)次數(shù)應(yīng)在平均值的20%以內(nèi)。

16. 繪制IL-2標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過樣品的吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的相應(yīng)濃度。