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            深圳市安培生物科技有限公司
            中級會(huì)員 | 第5年

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            葉綠體被膜完整性的測定

            時(shí)間:2023/1/16閱讀:1387
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            原理

            由于玻璃氰-化-鉀不能透過被膜,故完整葉綠體在等滲介質(zhì)中不能進(jìn)行玻璃氰-化-鉀光還原的Hill反應(yīng)。而失去完整被膜的葉綠體,鐵氰-化-鉀可以進(jìn)入類囊體進(jìn)行Hill反應(yīng)。根據(jù)這一原理,比較脹破與未脹破的葉綠體Hill反應(yīng)速率,就可計(jì)算葉綠體被膜的完整度。

            材料與儀器

            植物材料
            鐵氰-化-鉀 NH4Cl
            氧電極測氧全套裝置 燒杯 微量進(jìn)樣器 洗耳球

            步驟

            1. 取0.1ml葉綠體提取液加到0.9ml的蒸餾水中并攪拌1min,使葉綠體被膜脹破,加1ml測定介質(zhì)Ⅰ懸浮備用。


            2. 取0.1ml未脹破葉綠體提取液加入反應(yīng)杯中,視反應(yīng)杯體積加入測定介質(zhì)Ⅱ,加入適量鐵氰-化-鉀和NH4Cl,使鐵氰-化-鉀和NH4Cl的最終濃度都為1mmol/L。攪拌,平衡1min,照光測定Hill反應(yīng)放氧速率,記錄5min,然后清洗反應(yīng)杯。


            3. 將已脹破葉綠體加入反應(yīng)杯中,再加入適量測定介質(zhì)Ⅱ、鐵氰-化-鉀和NH4Cl,使反應(yīng)體系物質(zhì)最終濃度同未脹破葉綠體測定體系,測定過程同2。


            4. 分別計(jì)算脹破和未脹破的葉綠體測定體系中單位時(shí)間的放氧量(或Hill反應(yīng)速率)。


            5. 計(jì)算被膜完整度。

            注意事項(xiàng)

            1. 本實(shí)驗(yàn)所用玻璃要存放在冰箱中,存放時(shí)間不宜過長,最好現(xiàn)配現(xiàn)用。


            2. 葉綠體的分離要在0~4℃下進(jìn)行,玻璃器皿和溶液都須預(yù)冷,操作要快,整個(gè)分離過程最好在5min內(nèi)完成。


            3. 離心過程中離心機(jī)的轉(zhuǎn)速不宜過高,否則葉綠體中的淀粉粒會(huì)打破葉綠體被膜。


            4. 被膜完整度的測定過程中,反應(yīng)杯內(nèi)破碎葉綠體與完整葉綠體的葉綠素含量應(yīng)相等。

            常見問題

            葉綠體的外膜和內(nèi)膜合稱為被膜。葉綠體的外膜和內(nèi)膜都是連續(xù)的單位膜, 每層膜的厚度為6~8nm, 內(nèi)外兩膜間有10~20nm寬的間隙, 稱為膜間隙。與線粒體不同的是,葉綠體的內(nèi)膜并不向內(nèi)折成嵴, 但在某些植物中,內(nèi)膜可皺折形成相互連接的泡狀或管狀結(jié)構(gòu),稱為周質(zhì)網(wǎng)(peripheral reticulum),這種結(jié)構(gòu)的形成可增加內(nèi)膜的表面積。


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