自2018年最早獲批LNP獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)以來(lái)，LNPs迅速成為生物制藥行業(yè)主流的藥物遞送平臺(tái)。特別是在傳染病mRNA疫苗的開(kāi)發(fā)中，LNPs的應(yīng)用加速了這一趨勢(shì)。LNPs的靶向遞送通常通過(guò)兩種方法實(shí)現(xiàn)：一種是將LNPs與針對(duì)特定靶細(xì)胞表位的親和配體（如抗體）結(jié)合；另一種是通過(guò)篩選大量LNP配方，尋找具有特定器官趨向性的“物理化學(xué)靶向"LNPs。后者因易于體內(nèi)篩選和高效制造過(guò)程，在過(guò)去十年中成為學(xué)術(shù)界和工業(yè)界實(shí)現(xiàn)靶向遞送的主導(dǎo)方法。

然而，本研究在測(cè)試具有肺部趨向性的正電荷LNPs作為治療劑時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)這些LNPs能誘導(dǎo)嚴(yán)重的血栓形成。盡管納米粒子毒性的研究主要集中在補(bǔ)體蛋白和免疫球蛋白上，但凝血系統(tǒng)作為血漿的第三大防御系統(tǒng)，其被激活后可能產(chǎn)生最致命和急性的后果，卻往往被忽視。本文深入探討了這些LNPs誘導(dǎo)血栓形成的機(jī)制，并提出了多種解決方案，以在確保LNPs肺部靶向性的同時(shí)減輕其誘導(dǎo)的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在本研究中，我們制備了具有肺部趨向性的正電荷脂質(zhì)納米顆粒（+DOTAP LNPs），并通過(guò)尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)，以評(píng)估其誘導(dǎo)血栓形成的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，靜脈注射+DOTAP LNPs后，小鼠肺部出現(xiàn)明顯的血栓形成現(xiàn)象。具體而言，小鼠肺部組織在注射+DOTAP LNPs后30分鐘內(nèi)，呈現(xiàn)出類(lèi)似“肝樣化"的外觀，表現(xiàn)為肺部組織顏色鮮紅且質(zhì)地堅(jiān)硬（圖1d）。此外，通過(guò)測(cè)量小鼠注射LNPs后的活動(dòng)距離，我們發(fā)現(xiàn)+DOTAP LNP注射組小鼠的活動(dòng)能力顯著降低，表明這些小鼠出現(xiàn)了明顯的乏力癥狀（圖1e）。

為了進(jìn)一步量化+DOTAP LNPs誘導(dǎo)的肺損傷，我們收集了小鼠的支氣管肺泡灌洗液（BALF），并測(cè)量了其中的蛋白質(zhì)和白細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，隨著+DOTAP LNP注射劑量的增加，BALF中的蛋白質(zhì)和白細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著上升，表明+DOTAP LNPs導(dǎo)致了肺部毛細(xì)血管滲漏和炎癥反應(yīng)（圖1f）。特別地，在預(yù)先存在肺部炎癥的小鼠模型中（通過(guò)霧化吸入脂多糖LPS誘導(dǎo)），+DOTAP LNPs誘導(dǎo)的肺部損傷更為嚴(yán)重，BALF中的蛋白質(zhì)濃度較對(duì)照組高出近6倍（圖1g）。

為了探究+DOTAP LNPs誘導(dǎo)血栓形成的機(jī)制，我們進(jìn)行了一系列凝血相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。首先，通過(guò)肺組織切片染色，我們發(fā)現(xiàn)+DOTAP LNP注射組小鼠的肺部大血管和毛細(xì)血管中均存在大量血栓（圖2a）。進(jìn)一步地，我們測(cè)量了小鼠血漿中的凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（TAT）水平，這是凝血激活的標(biāo)志物。結(jié)果顯示，+DOTAP LNP注射組小鼠的血漿TAT水平較對(duì)照組顯著升高，且這一效應(yīng)在預(yù)先存在肺部炎癥的小鼠中更為顯著（圖2b）。

為了確定+DOTAP LNPs激活凝血的具體途徑，我們進(jìn)行了凝血酶原時(shí)間（PT）和活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）的檢測(cè)。PT主要反映外源性凝血途徑的激活情況，而APTT則主要反映內(nèi)源性凝血途徑的激活情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，+DOTAP LNPs對(duì)PT無(wú)顯著影響，但顯著縮短了APTT（圖2e-g），表明+DOTAP LNPs主要通過(guò)激活內(nèi)源性凝血途徑誘導(dǎo)凝血。

為了直接證明+DOTAP LNPs對(duì)血小板的激活作用，我們進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果顯示，+DOTAP LNP處理后的血小板表面P-選擇素（CD62p）的表達(dá)顯著增加，表明血小板處于高度激活狀態(tài)（圖3i）。此外，我們還發(fā)現(xiàn)+DOTAP LNPs能夠與血小板緊密結(jié)合，且這種結(jié)合作用顯著促進(jìn)了血小板的激活（圖3j, k）。

為了進(jìn)一步探究+DOTAP LNPs激活凝血的機(jī)制，我們進(jìn)行了纖維蛋白原結(jié)合實(shí)驗(yàn)。通過(guò)熒光標(biāo)記的纖維蛋白原與+DOTAP LNPs共孵育，并使用納米粒子跟蹤分析（NTA）檢測(cè)纖維蛋白原在LNPs上的聚集情況。結(jié)果顯示，+DOTAP LNPs能夠顯著促進(jìn)纖維蛋白原在其表面的聚集（圖4b-d）。進(jìn)一步地，我們通過(guò)放射性標(biāo)記的纖維蛋白原和LNPs在小鼠體內(nèi)的分布實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)+DOTAP LNPs能夠顯著增加肺部纖維蛋白原的攝取量（圖4e-g）。

為了證明纖維蛋白原在+DOTAP LNPs誘導(dǎo)凝血中的作用，我們使用組織型纖溶酶原激活劑（tPA）預(yù)處理血漿以消耗纖維蛋白原。結(jié)果顯示，在纖維蛋白原耗盡的血漿中，+DOTAP LNPs對(duì)血小板的激活作用顯著減弱（圖4l），表明纖維蛋白原在+DOTAP LNPs誘導(dǎo)的凝血過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。

為了驗(yàn)證我們提出的解決方案的有效性，我們進(jìn)行了抗凝治療和LNP表面修飾實(shí)驗(yàn)。首先，通過(guò)預(yù)先使用直接凝血酶抑制劑比伐蘆定處理小鼠，我們發(fā)現(xiàn)比伐蘆定能夠顯著減輕+DOTAP LNPs誘導(dǎo)的血栓形成，同時(shí)保留其肺部靶向性（圖5a-d）。其次，通過(guò)將直接凝血酶抑制劑PPACK共價(jià)結(jié)合到+DOTAP LNPs表面，我們也成功防止了血栓的形成（圖S16d，支持信息）。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)通過(guò)減小+DOTAP LNPs的尺寸至約80nm以下，可以顯著減少纖維蛋白原在其表面的聚集，從而防止血栓的形成（圖6）。具體來(lái)說(shuō)，80nm的+DOTAP LNPs在體外實(shí)驗(yàn)中幾乎不與纖維蛋白原結(jié)合（圖6c, d），且在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中不會(huì)導(dǎo)致肺部纖維蛋白原攝取量的顯著增加（圖6e, f），也不會(huì)在小鼠肺部誘導(dǎo)明顯的血栓形成（圖6h）。同時(shí)，80nm的+DOTAP LNPs仍然能夠保留其肺部靶向性，并在肺部有效表達(dá)mRNA（圖6i, j）。

討論

本研究創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)揭示了具有肺部趨向性的正電荷LNPs能夠誘導(dǎo)血栓形成的現(xiàn)象，并提出了多種解決方案以減輕這一風(fēng)險(xiǎn)。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)LNPs的安全性評(píng)估提出了新的要求，即在開(kāi)發(fā)LNPs作為藥物遞送系統(tǒng)時(shí)，必須充分考慮其可能誘導(dǎo)的凝血風(fēng)險(xiǎn)。

未來(lái)研究應(yīng)進(jìn)一步探討其他納米粒子特性（如機(jī)械性能、表面流動(dòng)性、聚合物刷邊界和附加蛋白質(zhì)等）與血栓形成之間的關(guān)系，并優(yōu)化現(xiàn)有的抗血栓技術(shù)，以確保正電荷LNPs在臨床應(yīng)用中的安全性。

結(jié)論

參考文獻(xiàn)：Serena Omo-Lamai, Marco E. Zamora, Manthan N. Patel, et al. Physicochemical Targeting of Lipid Nanoparticles to the Lungs Induces Clotting: Mechanisms and Solutions. Advanced Materials, 2024, 36(23): 2312026. DOI: 10.1002/adma.202312026.