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            上海盈東生物科技有限公司
            中級(jí)會(huì)員 | 第3年

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            abcam原裝抗體WB問題超全總結(jié)詳解無信號(hào),多條帶,高背景等難題 |靶點(diǎn)解惑

            時(shí)間:2023/5/9閱讀:2189
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            蛋白免疫印跡(WB)是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測(cè)特定樣品或提取物中某種特定蛋白的方法。聚丙烯酰胺凝膠緊貼著膜放置,常用的膜是硝酸纖維素或PVDF(聚偏乙烯氟化物),在電流的作用下蛋白質(zhì)從凝膠遷移到膜上并且被固定。膜是凝膠蛋白質(zhì)的復(fù)制品,然后可以與抗體結(jié)合后進(jìn)行染色。免疫印跡(WB)是一項(xiàng)通過凝膠電泳按照分子量大小分離蛋白,然后再利用特異性抗體識(shí)別這些蛋白的技術(shù)。它是對(duì)蛋白進(jìn)行定性和相對(duì)定量的重要檢測(cè)工具。

            您在WB實(shí)驗(yàn)時(shí)是否遇到無信號(hào)、高背景、多帶等問題?小編接下來將一一為您呈現(xiàn)這些問題的常見原因和解決方案。

            Chapter1



            無信號(hào)常見原因和解決方案


            WB實(shí)驗(yàn)時(shí)出現(xiàn)無信號(hào)或信號(hào)弱現(xiàn)象,小艾歸納整理發(fā)現(xiàn),主要是靶標(biāo)自身特性和WB實(shí)驗(yàn)流程中的樣本制備、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、洗膜和檢測(cè)等具體實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)問題會(huì)導(dǎo)致這一現(xiàn)象。接下來小艾跟大家詳細(xì)扒一扒具體細(xì)節(jié)有哪些。

            1.靶點(diǎn)特性導(dǎo)致無信號(hào)的常見原因及解決方案


            ▼ 組織或細(xì)胞中靶標(biāo)蛋白含量低導(dǎo)致無信號(hào)或信號(hào)弱


            可通過如下建議解決:


            參考文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)(例如The Human Protein Atlas)等,確認(rèn)靶標(biāo)蛋白是否在待檢組織或細(xì)胞中表達(dá)。我們總結(jié)了41個(gè)有表達(dá)特異性的熱門靶標(biāo)表達(dá)信息,供大家參考(附錄1)。


            增加上樣量,至少上樣20-30μg蛋白。


            濃縮使信號(hào)大化(例如檢測(cè)核蛋白要用核裂解物;檢測(cè)膜蛋白用膜裂解液,超速離心分離膜蛋白)。我們總結(jié)了58個(gè)熱門靶標(biāo)亞細(xì)胞定位信息,及其陽(yáng)性對(duì)照供大家參考(附錄2)。


            參考文獻(xiàn)或產(chǎn)品說明書,誘導(dǎo)增加靶標(biāo)蛋白表達(dá)。很多靶標(biāo)蛋白需要藥物誘導(dǎo)或其它特殊處理,其含量才能達(dá)到WB檢測(cè)范圍,我們整理了17個(gè)熱門靶標(biāo)蛋白在不同細(xì)胞系中藥物處理信息,及對(duì)應(yīng)產(chǎn)品供大家參考(附錄3)。


            選擇確認(rèn)表達(dá)靶標(biāo)蛋白的樣本作為陽(yáng)性對(duì)照(可參考產(chǎn)品說明書中提供的陽(yáng)性對(duì)照)。


            附錄1 熱門靶標(biāo)蛋白表達(dá)及陽(yáng)性對(duì)照

            靶標(biāo)名稱

            組織/細(xì)胞表達(dá)特異性(Uniprot)

            Alpha-synuclein

            •Alpha-synuclein主要在大腦中表達(dá),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸前末梢高度表達(dá)。

            •在除肝臟外的組織中也有少量表達(dá)。

            BDNF

            •BDNF在海馬、杏仁核、大腦皮層和小腦等腦組織中高度表達(dá)。

            •BDNF也表達(dá)于心臟、肺、骨骼肌、睪丸、前列腺和胎盤中。

            Caspase-3 /cleaved Caspase-3

            •在肺、脾、心臟、肝臟和腎臟中高度表達(dá)。

            •腦和骨骼肌內(nèi)中水平表達(dá),睪丸低水平表達(dá)。

            •在許多細(xì)胞系中表達(dá),在免疫系統(tǒng)細(xì)胞中的表達(dá)最高。

            ?點(diǎn)擊此處查看更多熱門靶標(biāo)組織/細(xì)胞表達(dá)特異性


            附錄2 熱門靶標(biāo)蛋白亞細(xì)胞定位及陽(yáng)性對(duì)照

            靶標(biāo)名稱

            蛋白亞細(xì)胞定位(Uniprot)

            陽(yáng)性對(duì)照

            Alpha-synuclein

            細(xì)胞膜,細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞核;也分泌于細(xì)胞連接、突觸和多巴胺能神經(jīng)元膜結(jié)合處。

            •WB:HAP1、HEK293-T細(xì)胞裂解液 ;人、大鼠腦組織裂解液 ;重組人Alpha-synuclein蛋白(?ab51189 。

            BDNF

            分泌型

            •WB:重組人/小鼠/大鼠BDNF蛋白(?ab9794) ;人,大鼠和小鼠的腦,海馬和小腦組織裂解液

            BrdU

            細(xì)胞核

            •IHC:來自BrdU 處理的小鼠的未染色切片(?ab129956)。

             •ICC:BrdU處理的HeLa 細(xì)胞。



            附錄3 熱門靶標(biāo)蛋白陽(yáng)性對(duì)照及藥物處理?xiàng)l件


            靶標(biāo)名稱

            細(xì)胞系

            試劑處理

            產(chǎn)品

            c-Fos

            HeLa

            血清饑餓36小時(shí),20% FBS(2小時(shí))

            ?ab214672

            Jurkat

            血清饑餓過夜,PMA(200 nM, 4 小時(shí))

            RAW 264.7

            血清饑餓過夜,PMA(200 nM, 4 小時(shí))

            Cleaved Caspase-3

            HAP1

            星形孢菌素(2 μM, 24小時(shí))

            ?ab32042

            HeLa

            星形孢菌素(2 μM, 24小時(shí))

            cleaved N-terminal DFNA5 / GSDME

            SH-SY5Y

            Etoposide(60 μM ,14小時(shí))

            ?ab222408

            ?點(diǎn)擊此處查看更多熱門靶標(biāo)蛋白陽(yáng)性對(duì)照及藥物處理?xiàng)l件


            ▼組織或細(xì)胞中修飾后(磷酸化、乙酰化和泛素化等)的靶標(biāo)蛋白含量底,可導(dǎo)致無信號(hào)或信號(hào)弱現(xiàn)象

            可通過如下建議解決:


            通常情況下,在未處理的組織或細(xì)胞中,大部分翻譯后修飾狀態(tài)下的蛋白含量較少。


            參考文獻(xiàn)或產(chǎn)品說明書,誘導(dǎo)增加靶標(biāo)蛋白含量。我們整理了25個(gè)熱門靶標(biāo),在不同細(xì)胞系中檢測(cè)其翻譯后修飾形式,需藥物處理?xiàng)l件及對(duì)應(yīng)的產(chǎn)品,供大家參考(附錄3)。


            裂解緩沖液中使用相應(yīng)去修飾酶抑制劑。(例如靶蛋白磷酸化檢測(cè),裂解液中需增加磷酸酶抑制劑)


            陽(yáng)性對(duì)照(參考產(chǎn)品說明書中誘導(dǎo)試劑和條件,處理樣本。)


            附錄3 翻譯后修飾靶標(biāo)蛋白陽(yáng)性對(duì)照及藥物處理?xiàng)l件

            靶標(biāo)名稱

            細(xì)胞系

            試劑處理

            產(chǎn)品

            eNOS(phospho S1177)

            HUVEC

            Pervanadate(100 uM,10分鐘)

            ?ab215717

            JAK2(phospho Y1007 + Y1008)

            Jurkat

            Pervanadate(50 mM ,5分鐘)

            ?ab32101

            C6 

            Pervanadate(50 mM,5分鐘)

            Hepa1-6

            Pervanadate(100 µM,30分鐘)

            MEF

            Pervanadate(100 µM,30分鐘)

            MLKL(phospho S345)

            L-929

            20 ng/ml TNF alpha,100 nM Smac mimetic和20 µM z-VAD(8小時(shí))

            ?ab196436

            ?點(diǎn)擊此處查看更多翻譯后修飾靶標(biāo)蛋白陽(yáng)性對(duì)照及藥物處理?xiàng)l件

            注:具體細(xì)胞系處理信息請(qǐng)參考產(chǎn)品說明書


            ▼靶標(biāo)蛋白是分泌型蛋白,檢測(cè)時(shí)分泌到細(xì)胞外,若檢測(cè)的樣本為全細(xì)胞裂解液,會(huì)出現(xiàn)無信號(hào)或信號(hào)弱現(xiàn)象

            可通過如下建議解決:


            使用 Brefeldin A(BFA)抑制蛋白分泌,提取全細(xì)胞裂解液。


            如果全細(xì)胞裂解液中檢測(cè)不到靶蛋白,建議提取細(xì)胞培養(yǎng)上清中的蛋白。




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