哈嘍寶子們，我最近遇到了一個難纏的蛋白，用大腸桿菌表達(dá)后會出現(xiàn)在沉淀中。如果從沉淀中提取純化，操作復(fù)雜姑且不論，還有可能沒有活性！如果優(yōu)化培養(yǎng)條件讓它在上清中表達(dá)，需要慢慢摸索，費(fèi)時費(fèi)力還不一定成功。這幾天為了思考解決辦法，真是要茶飯不思了！
閉門造車不如出門取經(jīng)，這不，我在萬能的師兄這里求來了一樣新“法寶"，據(jù)說它可以讓包涵體蛋白在上清中表達(dá)。今天讓我們一起來看一下它究竟“威能"如何吧！內(nèi)含我的真實(shí)實(shí)驗(yàn)步驟+結(jié)果+操作Tips哦。
如何拯救包涵體蛋白？
“法寶"顯威——無細(xì)胞蛋白表達(dá)試劑盒初體驗(yàn)
一、使用前準(zhǔn)備
打開試劑盒，讓我們看一下它的廬山真面目。
試劑盒內(nèi)一共三個組分，分別是：
組分A、組分B、PC（陽性對照質(zhì)粒）。
將各組分取出，在冰上融化。
二、模板準(zhǔn)備
與原核細(xì)胞表達(dá)不同，這款無細(xì)胞試劑盒可以不用質(zhì)粒模板，只需要在目的基因上下游引入T7轉(zhuǎn)錄表達(dá)原件，構(gòu)建一個線性模板。
第一步，用PCR分別獲得5UTR片段，3UTR片段以及目的基因片段；
第二步，用重疊PCR方法，將上一步獲得的目的基因片段和5UTR片段，3UTR片段拼接稱完整的線性表達(dá)模板。
三、體系構(gòu)建
由于是初次嘗試，我這次選擇50μL的總體積。在96孔板中反應(yīng)，按照這張表加試劑和構(gòu)建好的DNA模板5μL（體系體積的1/10），用移液槍反復(fù)吹打混勻。
試劑 | 陰性對照（μL） | 陽性對照（μL） | 實(shí)驗(yàn)組（μL） |
組分A | 20.5 | 20.5 | 20.5 |
組分B | 16.7 | 16.7 | 16.7 |
DNA模板 | / | 5 | 5 |
雙蒸水 | 12.8 | 7.8 | 7.8 |
反應(yīng)總體積 | 50 | 50 | 50 |
四、孵育
將混合好的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至搖床中，溫度25℃、180rpm，反應(yīng)16h，確保蛋白表達(dá)。
孵育四小時后，迫不及待先看一下GFP的表達(dá)情況，觀察到陽性對照已有明顯綠色熒光。
五、收獲
次日一早，打開搖床就看到了陽性對照醒目的綠色熒光。既然陽性對照表達(dá)了，目標(biāo)蛋白想來不成問題！滿懷期待開始離心、跑膠鑒定。
六、鑒定
將陰性對照和實(shí)驗(yàn)組分別制洗脫樣、上清樣、沉淀樣，上樣量：洗脫樣、上清樣10μL，沉淀樣5μL。電泳條件：12%SDS-PAGE膠，100V，1.5h。
不愧是師兄力薦的“法寶"，沒有辜負(fù)我的厚望，第一次實(shí)驗(yàn)，我的蛋白就在上清中成功表達(dá)了！
七、總結(jié)
這次實(shí)驗(yàn)真是一次全新的體驗(yàn)。在無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系下，整個實(shí)驗(yàn)從模板構(gòu)建、反應(yīng)體系構(gòu)建、孵育、到最后收獲目標(biāo)蛋白并鑒定，只用了兩天時間，不但在上清中表達(dá)出了原核細(xì)胞表達(dá)中會形成包涵體的蛋白，還大大縮短了實(shí)驗(yàn)時間。真讓我有把所有蛋白都用無細(xì)胞體系表達(dá)的沖動！
1.無細(xì)胞蛋白表達(dá)試劑盒可以用線性模板也可以用質(zhì)粒模板，線性模板更加方便快捷，但是質(zhì)粒模板表達(dá)量一般較高。
2.組分A、B在實(shí)驗(yàn)前要提前放在冰上融化，防止試劑失效。使用前先用移液槍吹打混勻，再吸取相應(yīng)體積。
3.微孔板四周可以加入適量雙蒸水，防止孵育過程中體系水分蒸發(fā)。本次實(shí)驗(yàn)因?yàn)橐^夜表達(dá)，為了確保反應(yīng)體系不被蒸干，我在96孔板最外側(cè)一周的所有孔位里都加了水，而且在搖床四角也各放置了一只裝水的離心管。
4.對于復(fù)雜蛋白表達(dá)，可以延長孵育時間，保證蛋白充分表達(dá)。
5.如果調(diào)整反應(yīng)體積，需要按照說明書推薦隨之調(diào)整反應(yīng)容器。
CFPS——蛋白表達(dá)“新勢力"
初次表達(dá)包涵體大獲成功，無細(xì)胞蛋白表達(dá)究竟是“何方神圣"？在實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，我粗略了解了一下這一新技術(shù)，發(fā)現(xiàn)它的強(qiáng)大不止于此。
無細(xì)胞蛋白表達(dá)（Cell-free protein expression，CFPS）是指將細(xì)胞內(nèi)合成蛋白所需要的RNA聚合酶、核糖體及轉(zhuǎn)錄翻譯輔助因子等分子機(jī)器提取出來，并輔以核苷酸、氨基酸、能量物質(zhì)及基因模板，在沒有活細(xì)胞參與的體外直接合成蛋白質(zhì)的生物合成反應(yīng)。
受細(xì)胞自身生理功能限制，有些蛋白在傳統(tǒng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)量低甚至不能表達(dá)，而無細(xì)胞系統(tǒng)可以擺脫這種限制，廣泛適用于細(xì)胞因子、抗體、膜蛋白、毒性蛋白、包涵體蛋白表達(dá)等場景。此外，無細(xì)胞蛋白表達(dá)反應(yīng)周期短、易與自動化設(shè)備結(jié)合、自由度與可控程度高，適合蛋白快速交付、酶定向進(jìn)化篩選、AI蛋白制造、ADC藥物開發(fā)等領(lǐng)域，可謂是蛋白表達(dá)領(lǐng)域的“新勢力"。
隨著合成生物學(xué)發(fā)展，無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)已然嶄露頭角，大有騰飛之勢。技術(shù)的發(fā)展是推動科學(xué)研究進(jìn)步的重要助力，善于利用新技術(shù)，有時能使科研過程事半功倍，我也算是深有體會了！
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