參考清華大學(xué)盧元教授的文章
《無細(xì)胞體系非天然蛋白質(zhì)合成研究進(jìn)展》
為什么用cell-free系統(tǒng)（CFUPS）
非天然氨基酸表達(dá)難點(diǎn)：
（1）目標(biāo)蛋白合成途徑非細(xì)胞內(nèi)主反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)量較低，純化步驟繁瑣；
（2）某些UNAAs不易穿過細(xì)胞膜屏障進(jìn)入細(xì)胞，從而降低了細(xì)胞對UNAAs的利用率，限制UNAAs嵌入效率；
（3）非天然氨基酸的細(xì)胞毒性；
這些導(dǎo)致體內(nèi)UNAAs的嵌入效率較低，特別是在多位點(diǎn)UNAAs嵌入時(shí)尤為明顯。
無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)（Cell-free protein synthesis, CFS）是一種在沒有活細(xì)胞的情況下，利用細(xì)胞提取物進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的技術(shù)。這種技術(shù)允許科學(xué)家在體外環(huán)境中合成蛋白質(zhì)，而無需依賴細(xì)胞的內(nèi)部機(jī)制。隨著技術(shù)的發(fā)展，無細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)（CFUPS）進(jìn)一步擴(kuò)展了這一概念，允許合成含有非天然氨基酸（UNAAs）的蛋白質(zhì)。
在CFUPS中，使用外源DNA或mRNA作為模板，這些模板編碼的蛋白質(zhì)序列包含非天然氨基酸。然后，將底物、能量物質(zhì)、輔因子和非天然組分添加到反應(yīng)體系中。這些非天然組分包括正交氨酰tRNA合成酶/正交tRNA（o-aaRS/o-tRNA）對，它們是專門設(shè)計(jì)的酶和tRNA，能夠識別并結(jié)合非天然氨基酸。在細(xì)胞提取物提供的多種酶的作用下，這些非天然氨基酸被整合到蛋白質(zhì)鏈中，從而合成出含有非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。
CFUPS與細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成相比具有諸多的優(yōu)點(diǎn)
2. 怎么做：無細(xì)胞體系UNAAs嵌入的方法
在無細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)（CFUPS）中，嵌入非天然氨基酸（UNAAs）的方法是實(shí)現(xiàn)非天然蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵。以下是一些主要的嵌入方法，它們在CFUPS中被廣泛使用：
（1）全局抑制：這種方法通過使用突變的釋放因子（release factors）或tRNAs來抑制正常的終止密碼子，使得翻譯過程在遇到終止密碼子時(shí)不會停止，而是繼續(xù)添加非天然氨基酸。
（2）終止密碼子抑制：這種方法利用特定的突變釋放因子，它們能夠識別終止密碼子，但不會終止翻譯過程，而是允許非天然氨基酸的插入。
（3）移碼抑制：這種方法通過改變mRNA的讀取框架來實(shí)現(xiàn)非天然氨基酸的嵌入。通過特定的策略，如使用特定的tRNAs或突變的tRNAs，可以在特定的位置插入非天然氨基酸，而不影響蛋白質(zhì)的其余部分。
（4）有義密碼子再分配：這種方法涉及將一個(gè)原本編碼天然氨基酸的密碼子重新分配給非天然氨基酸。這通常通過使用突變的tRNAs來實(shí)現(xiàn)，這些tRNAs能夠識別特定的有義密碼子，并將非天然氨基酸添加到蛋白質(zhì)鏈中。
（5）非天然堿基對：這種方法通過擴(kuò)展遺傳密碼來實(shí)現(xiàn)非天然氨基酸的嵌入。通過引入新的堿基對，可以編碼更多的氨基酸，包括非天然氨基酸。這通常涉及到使用經(jīng)過工程改造的聚合酶和tRNAs。
這些方法的發(fā)展和應(yīng)用，使得科學(xué)家能夠在蛋白質(zhì)合成過程中精確地控制非天然氨基酸的位置，從而為蛋白質(zhì)工程和藥物設(shè)計(jì)提供了新的工具。
3. 非天然氨基酸蛋白有什么用？
無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)（CFUPS）在合成具有特定功能的非天然蛋白質(zhì)方面取得了顯著進(jìn)展，并在多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出其重要性和應(yīng)用潛力。以下是一些主要的應(yīng)用領(lǐng)域：
（1）蛋白藥物合成：CFUPS可以用于合成具有治療潛力的蛋白質(zhì)藥物，包括抗體、酶和激素等。通過在蛋白質(zhì)中嵌入非天然氨基酸，可以提高藥物的穩(wěn)定性、延長半衰期或增強(qiáng)其生物活性。
（2）病毒樣顆粒（Virus-like particles, VLPs）：VLPs是模仿病毒結(jié)構(gòu)的納米級顆粒，但不含病毒遺傳物質(zhì)，因此不具有傳染性。CFUPS可以用于合成VLPs，這些顆粒在疫苗開發(fā)和藥物遞送系統(tǒng)中具有應(yīng)用潛力。
（3）膜蛋白合成：膜蛋白在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和能量轉(zhuǎn)換等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CFUPS可以用于合成具有特定功能的膜蛋白，這有助于研究其結(jié)構(gòu)和功能，以及開發(fā)針對這些蛋白的藥物。
（4）蛋白質(zhì)材料：CFUPS可以用于合成具有特定物理或化學(xué)性質(zhì)的蛋白質(zhì)材料，這些材料可以用于組織工程、生物傳感器或納米技術(shù)等領(lǐng)域。
（5）蛋白質(zhì)間相互作用研究：CFUPS提供了一種工具，用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，這對于理解細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑和開發(fā)新的干預(yù)策略至關(guān)重要。
（6）開發(fā)新型蛋白材料：通過CFUPS合成的非天然蛋白質(zhì)可以被設(shè)計(jì)成具有特定的結(jié)構(gòu)和功能，用于開發(fā)新型的生物材料，這些材料可能具有的機(jī)械性能或生物相容性。
4. 后續(xù)開發(fā)方向
UNAA嵌入位點(diǎn)的選擇：選擇合適的非天然氨基酸（UNAA）嵌入位點(diǎn)。
多位點(diǎn)UNAA嵌入：實(shí)現(xiàn)在蛋白質(zhì)中多個(gè)位點(diǎn)嵌入U(xiǎn)NAAs。
與內(nèi)源元素的交叉反應(yīng)：避免與細(xì)胞內(nèi)源性成分的反應(yīng)。
UNAA嵌入效率低：提高UNAA嵌入的效率。
困難的核糖體工程：改進(jìn)核糖體工程以適應(yīng)非天然氨基酸的合成。
缺乏可擴(kuò)展的系統(tǒng)：開發(fā)可大規(guī)模應(yīng)用的CFUPS系統(tǒng)。
高成本：降低CFUPS系統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)成本。
耗費(fèi)時(shí)間和勞動(dòng)力：減少制備、純化和分析過程中的時(shí)間和勞動(dòng)力消耗。
開發(fā)非天然蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)折疊預(yù)測算法：幫助預(yù)測UNAAs嵌入后蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。
開發(fā)無需純化的高通量篩選方法：簡化篩選過程，提高效率。
篩選更多正交翻譯對：增加可用于UNAA嵌入的正交氨酰tRNA合成酶/正交tRNA對。
加速開發(fā)移碼抑制、有義密碼子再分配和非天然堿基對方法：推動(dòng)這些嵌入技術(shù)的發(fā)展。
進(jìn)化正交翻譯對：通過進(jìn)化生物學(xué)方法改進(jìn)正交翻譯對的性能。
工程化底盤生物：通過基因工程改造底盤生物以適應(yīng)CFUPS系統(tǒng)。
優(yōu)化CFUPS系統(tǒng)的成分組成：調(diào)整反應(yīng)體系以提高UNAA嵌入效率。
發(fā)展體外核糖體進(jìn)化平臺：用于改進(jìn)核糖體以適應(yīng)非天然氨基酸的合成。
模仿標(biāo)準(zhǔn)生物反應(yīng)器配置：在大規(guī)模生產(chǎn)中應(yīng)用CFUPS系統(tǒng)。
簡化產(chǎn)品分析方法：減少分析過程中的復(fù)雜性。
自行合成試劑：包括UNAAs、tRNAs等，以降低成本。
優(yōu)化能量供給系統(tǒng)：改進(jìn)CFUPS系統(tǒng)中的能量供應(yīng)。
優(yōu)化細(xì)胞提取物、表達(dá)模板和OTS組分的制備：提高制備過程的效率和成本效益。
簡化制備過程：減少制備過程中的時(shí)間和勞動(dòng)力消耗。
簡化純化和分析過程：提高純化和分析的效率。
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