Human殘留 DNA檢測試劑盒（qPCR-熒光探針法）說明書

貨號： HG-HD001

產(chǎn)品簡介：

Huamn殘留DNA檢測試劑盒是用于定量檢測各種生物制品中間品、半成品及成品中Human宿主DNA的專用試劑盒，本試劑盒利用Taqman探針原理，定量檢測樣本中Human殘留DNA。檢測快速，專一性強，性能可靠，最i低檢測限可達到fg水平。
配套樣品前處理試劑盒（貨號為HG-CL100）進行樣品的前處理。
試劑盒配套Human DNA定量參考品為國家標(biāo)準(zhǔn)品。
檢測范圍：3×10¹ fg/μL~3×10⁵ fg/μL

規(guī)格：

100 Reactions

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品儲存條件與有限期：

存儲條件見上表，有效期18個月。

需要準(zhǔn)備的耗材與設(shè)備
實驗前請準(zhǔn)備好下列耗材與設(shè)備：
◆1.5mL或2mL無菌低吸附離心管
◆ 與PCR儀適配的96孔qPCR板或八聯(lián)排管
◆ 1000μL，200μL，10μL無菌低吸附帶濾芯槍頭
◆ 熒光定量PCR儀
◆ 水浴鍋/金屬浴

◆ 離心機
◆ 震蕩器
◆ 各規(guī)格移液器（如1000μL，200μL，10μL，2.5μL等）
◆ 磁力架

實驗步驟：

一、 樣品前處理

詳見我司樣品前處理試劑盒（貨號為HG-CL100）操作說明書。

二、 qPCR操作步驟

1. 定量參考品及NCS、NTC的制備
 1.1 定量參考品：取出Human DNA定量參考品、DNA稀釋液置于冰上融化；待完i全融化后，輕微振蕩混勻，瞬時離心；
 1.2 取 6 支干凈的1.5mL離心管，分別標(biāo)記為ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5；
 1.3 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋過程如下表

 1.4 NCS 的制備：取100μL DNA稀釋液與樣品同時進行前處理，純化洗脫后的產(chǎn)物即為NCS。
 1.5 NTC 的制備：100uL DNA稀釋液；
 1.6 加標(biāo)回收ERC：建議90uL樣品+10uL ST3，也可根據(jù)實際情況按照其他方式制備。
2. q-PCR 反應(yīng)液的制備和加樣
 2.1 根據(jù)所需檢測的標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品數(shù)量（一般做 3 個復(fù)孔），計算所需孔數(shù)：
       反應(yīng)孔數(shù) =（5 個濃度梯度的標(biāo)曲 +2 個陰性對照 NTC 和 NCS+ 待測樣品）×3
 2.2 根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計算本次所需的 qPCR Mix 總量：
       qPCR Mix=（反應(yīng)孔數(shù) +2 或 3）× 15μL（2 或 3 為操作損失量）
 2.3 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按下表所示配制 qPCR Mix。

qPCR Mix配制表

*請對應(yīng)機型選擇適配的ROX；若機型適配為no ROX，請加入等體積的去離子水（要求無核酸及核酸酶污染）。

3. 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按下表所示加樣（總體積20μL）：

各反應(yīng)孔加樣示例

4.實驗需使用qPCR實驗專用的八聯(lián)管或者96孔板進行反應(yīng)，需去除反應(yīng)體系中的氣泡，并離心將液體離至管底準(zhǔn)備反應(yīng)。
5.反應(yīng)孔排版示例

96孔板排版示例

三、 qPCR反應(yīng)程序和參數(shù)設(shè)置

（以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例。）

1.創(chuàng)建實驗反應(yīng)程序，設(shè)置兩步法反應(yīng)程序如下表：

2.創(chuàng)建實驗反應(yīng)板，點擊Select Fluorophores選擇熒光FAM；在反應(yīng)板圖表中，選擇樣品孔，在Sample Type中下拉選擇Unknow，勾選熒光FAM，Target Name命名為Human-DNA；輸入每個樣品的重復(fù)次數(shù)及Sample Name；
3.在反應(yīng)板圖表中，選擇標(biāo)曲孔，在Sample Type中下拉選擇Standard，勾選熒光FAM，Target Name命名為Human-DNA；輸入每個稀釋梯度的重復(fù)次數(shù)及Sample Name。分別在ST1、ST2、ST3、ST4、ST5的Concentration一欄賦值為3.00E+05、3.00E+04、3.00E+03、3.00E+02、3.00E+01（單位為fg/μL）；
4.點擊Run界面“Start Run"按鈕進行PCR測定。

四、 qPCR結(jié)果分析

以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例
1. 點擊資料分析視窗Quantitation，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）、擴增效率（Effect）、R2。
2. 在視窗Quantitation Data 中，SQ Mean 一欄可讀取無模板對照NTC、NCS、待測樣本的檢測值，單位為fg/μL。
3. 數(shù)據(jù)可靠性評估：
• 三個平行孔間Ct值差應(yīng)小于1.0，Ct值大于35的孔除外；
• 陰性對照NTC和NCS的CT值都應(yīng)大于標(biāo)曲最i低濃度的CT值或根據(jù)實驗室自身驗證結(jié)果設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)；
• 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.98，擴增效率85%~110%之間；
• ERC回收率在50%~150%之間（加標(biāo)回收率=ERC/(0.9*樣品+0.1*ST3)。

注意事項：

1. 本試劑盒已通過穩(wěn)定性（凍融等因素）的驗證，無需分裝。
2. 陰性樣品和陽性樣品（參考品和待測樣品等）的配制環(huán)境需區(qū)分區(qū)域，不可在一個區(qū)域內(nèi)操作，配制人員需穿戴整齊，戴
好口罩、手套和穿好潔凈服。
3. 注意在不同加樣步驟間及時更換吸頭，避免交叉污染，避免長時開蓋。
4. 試劑盒必須在有效期內(nèi)使用。
5. 試劑盒內(nèi)所有組分建議在低溫環(huán)境融化后使用。
6. 只有嚴(yán)格遵守說明書的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證優(yōu)良檢測效果。
7. 盡量在當(dāng)天完成樣本前處理純化后立即進行后續(xù)qPCR檢測，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
8. 最終的試驗結(jié)果與試劑的有效性、操作者的操作方法及試驗環(huán)境密切相關(guān)。
9. 公司只對試劑盒本身負責(zé)，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責(zé)，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，
預(yù)留充足的樣本。
10. 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷。