目錄:柏萊源（天津）生物科技有限公司>>生物試劑>>試劑盒kit>> HG-HD003HEK293細胞殘留DNA檢測試劑盒
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100 Reactions |
|---|---|---|---|
| 應用領域 | 生物產(chǎn)業(yè),制藥/生物制藥 |
貨號： HG-HD003
HEK293 細胞殘留 DNA 檢測試劑盒是用于定量檢測各種生物制品中間品、半成品及成品中 HEK293 細胞 DNA 的專用試劑盒，本試劑盒利用 Taqman 探針原理，定量檢測樣本中 HEK293 細胞殘留 DNA。檢測快速，專一性強，性能可靠，最i低檢測限可達到fg 水平。配套樣品前處理試劑盒（貨號為 HG-CL100）進行樣品的前處理。
檢測范圍：3×101fg/μL~3×105fg/μL
100 Reactions
| 組分 | 規(guī)格 | 存儲條件 |
|---|---|---|
| HEK293 細胞 DNA 定量參考品（30ng/μL） | 50μL×1 管 | -20℃ |
| HEK293 Primer&Probe MIX | 550μL×1管 | -20℃ |
| 2×qPCR Reaction Buffer | 1.2mL×1 管 | -20℃ |
| DNA稀釋液 | 1.5mL×3 管 | -20℃ |
| ROX High | 50μL×1 管 | -20℃ |
| ROX Low | 50μL×1管 | -20℃ |
存儲條件見上表，有效期18個月。
◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A（博日）
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480
配合不同機型使用時，請注意選擇適配的參比染料 ROX
| 儀器 | ROX參比染料 |
| Applied Biosystems®5700,7000,7300,7700,7900HT,StepOneTM,and StepOnePlusTTM | ROX High |
| Applied Biosystems®7500,ViiATM 7,QuantStudioTM12K Flex,Agilent Mx3000PTM,Mx3005PTM,and Mx4000TM | ROX Low |
| Rotor-GeneTM,DNA Engine OpticonTM,OpticonTM2,Chromo 4TMReal-Time Detector,Mastercycler®ep realplex, Smart Cycler®,Roche LightCycle®480,Roche LightCycler®Nano,Bio-Rad CFX96,and llumina EcoTM | No ROX |
實驗前請準備好下列耗材與設備：
◆1.5mL或2mL無菌低吸附離心管
◆ 與PCR儀適配的96孔qPCR板或八聯(lián)排管
◆ 1000μL，200μL，10μL無菌低吸附帶濾芯槍頭
◆ 熒光定量PCR儀
◆ 水浴鍋/金屬浴
◆ 離心機
◆ 震蕩器
◆ 各規(guī)格移液器（如1000μL，200μL，10μL，2.5μL等）
◆ 磁力架
詳見我司樣品前處理試劑盒（貨號為HG-CL100）操作說明書。
1. 定量參考品及NCS、NTC的制備
1.1 定量參考品：取出Human DNA定量參考品、DNA稀釋液置于冰上融化；待完i全融化后，輕微振蕩混勻，瞬時離心；
1.2 取 6 支干凈的1.5mL離心管，分別標記為ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5；
1.3 標準品稀釋過程如下表
| 標準品代號 | 稀釋體積 | 濃度(fg/μL) |
| ST0 | 10μL Human DNA 定量參考品 + 90μL DNA稀釋液 | 3 × 106 |
| ST1 | 10μL ST0 + 90μL DNA 稀釋液 | 3 × 105 |
| ST2 | 10μL ST1 + 90μL DNA 稀釋液 | 3 × 104 |
| ST3 | 10μL ST2 + 90μL DNA 稀釋液 | 3 × 103 |
| ST4 | 10μL ST3 + 90μL DNA 稀釋液 | 3 × 102 |
| ST5 | 10μL ST4 + 90μL DNA 稀釋液 | 3 × 101 |
1.4 NCS 的制備：取100μL DNA稀釋液與樣品同時進行前處理，純化洗脫后的產(chǎn)物即為NCS。
1.5 NTC 的制備：100uL DNA稀釋液；
1.6 加標回收ERC：建議90uL樣品+10uL ST3，也可根據(jù)實際情況按照其他方式制備。
2. q-PCR 反應液的制備和加樣
2.1 根據(jù)所需檢測的標準樣品和待測樣品數(shù)量（一般做 3 個復孔），計算所需孔數(shù)：
反應孔數(shù) =（5 個濃度梯度的標曲 +2 個陰性對照 NTC 和 NCS+ 待測樣品）×3
2.2 根據(jù)反應孔數(shù)計算本次所需的 qPCR Mix 總量：
qPCR Mix=（反應孔數(shù) +2 或 3）× 15μL（2 或 3 為操作損失量）
2.3 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按下表所示配制 qPCR Mix。
| 組分 | 單孔反應(μL) |
| 2x qPCR Reaction Buffer | 10 |
| Human Primer&Probe Mix | 4.6 |
| ROX* | 0.4 |
| 總體積 | 15 |
qPCR Mix配制表
*請對應機型選擇適配的ROX；若機型適配為no ROX，請加入等體積的去離子水（要求無核酸及核酸酶污染）。
3. 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按下表所示加樣（總體積20μL）：
| 參考品 | 15μL qPCR Mix +5μL ST1/2/3/4/5 |
| 陰性對照 | 15μL qPCR Mix +5μL NTC/NCS |
| 待測樣品 | 15μL qPCR Mix +5μL待測樣本 |
各反應孔加樣示例
4.實驗需使用qPCR實驗專用的八聯(lián)管或者96孔板進行反應，需去除反應體系中的氣泡，并離心將液體離至管底準備反應。
5.反應孔排版示例
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | ST1 | ST1 | ST1 | S1 | S1 | S1 | ||||||
| B | ST2 | ST2 | ST2 | S2 | S2 | S2 | ||||||
| C | ST3 | ST3 | ST3 | S3 | S3 | S3 | ||||||
| D | ST4 | ST4 | ST4 | |||||||||
| E | ST5 | ST5 | ST5 | |||||||||
| F | ERC -S1 | ERC -S1 | ERC -S1 | |||||||||
| G | NTC | NTC | NTC | ERC -S2 | ERC -S2 | ERC -S2 | ||||||
| H | NCS | NCS | NCS | ERC -S3 | ERC -S3 | ERC -S3 |
96孔板排版示例
（以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例。）
1.創(chuàng)建實驗反應程序，設置兩步法反應程序如下表：
| Stage1 | 預變性 | Reps:1 | 95℃ | 2min |
| Stage2 | 循環(huán)反應 | Reps:40 | 95℃ | 15s |
| 60℃ | 30s |
2.創(chuàng)建實驗反應板，點擊Select Fluorophores選擇熒光FAM；在反應板圖表中，選擇樣品孔，在Sample Type中下拉選擇Unknow，勾選熒光FAM，Target Name命名為Human-DNA；輸入每個樣品的重復次數(shù)及Sample Name；
3.在反應板圖表中，選擇標曲孔，在Sample Type中下拉選擇Standard，勾選熒光FAM，Target Name命名為Human-DNA；輸入每個稀釋梯度的重復次數(shù)及Sample Name。分別在ST1、ST2、ST3、ST4、ST5的Concentration一欄賦值為3.00E+05、3.00E+04、3.00E+03、3.00E+02、3.00E+01（單位為fg/μL）；
4.點擊Run界面“Start Run"按鈕進行PCR測定。
以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例
1. 點擊資料分析視窗Quantitation，可讀取標準曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）、擴增效率（Effect）、R2。
2. 在視窗Quantitation Data 中，SQ Mean 一欄可讀取無模板對照NTC、NCS、待測樣本的檢測值，單位為fg/μL。
3. 數(shù)據(jù)可靠性評估：
• 三個平行孔間Ct值差應小于1.0，Ct值大于35的孔除外；
• 陰性對照NTC和NCS的CT值都應大于標曲最i低濃度的CT值或根據(jù)實驗室自身驗證結果設定標準；
• 標準曲線線性相關系數(shù)R2≥0.98，擴增效率85%~110%之間；
• ERC回收率在50%~150%之間（加標回收率=ERC/(0.9*樣品+0.1*ST3)。
1. 本試劑盒已通過穩(wěn)定性（凍融等因素）的驗證，無需分裝。
2. 陰性樣品和陽性樣品（參考品和待測樣品等）的配制環(huán)境需區(qū)分區(qū)域，不可在一個區(qū)域內(nèi)操作，配制人員需穿戴整齊，戴
好口罩、手套和穿好潔凈服。
3. 注意在不同加樣步驟間及時更換吸頭，避免交叉污染，避免長時開蓋。
4. 試劑盒必須在有效期內(nèi)使用。
5. 試劑盒內(nèi)所有組分建議在低溫環(huán)境融化后使用。
6. 只有嚴格遵守說明書的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證優(yōu)良檢測效果。
7. 盡量在當天完成樣本前處理純化后立即進行后續(xù)qPCR檢測，以保證檢測結果的準確性。
8. 最終的試驗結果與試劑的有效性、操作者的操作方法及試驗環(huán)境密切相關。
9. 公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，
預留充足的樣本。
10. 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷。
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柏萊源（天津）生物科技有限公司的優(yōu)勢：
現(xiàn)貨供應：公司庫存充足，可快速發(fā)貨，減少用戶等待時間。
效期保障：嚴格把控產(chǎn)品質量，確保試劑效期新鮮，保障實驗結果的可靠性。
專業(yè)技術支持：提供詳細的實驗方案和技術指導，幫助用戶優(yōu)化實驗條件，提高實驗成功率。
定制化服務：根據(jù)用戶需求，提供個性化的產(chǎn)品和服務解決方案。
售后保障：完善的售后服務體系，及時解決用戶在使用過程中遇到的問題。
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