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RT-qPCR用 Maxima鏈cDNA合成試劑盒

RT-qPCR 用 Thermo Scientific Maxima 鏈 cDNA 合成試劑盒是一種針對(duì)兩步法定量 RT-PCR (RT-qPCR) 應(yīng)用中的 cDNA 合成進(jìn)行優(yōu)化的便捷系統(tǒng)。該試劑盒采用 Maxima 逆轉(zhuǎn)錄酶 (RT)，這是 M-MuLV RT 經(jīng)體外進(jìn)化而得到的一種高級(jí)酶。與野生型 M-MuLV RT 相比，該酶具有較高的熱穩(wěn)定性和耐受性且 cDNA 合成速率提高。

RT-qPCR 用 Maxima 鏈 cDNA 合成試劑盒能夠在較高溫度（42 至 65°C）下從較寬范圍的 RNA 總量（1 pg 至 5 µg）進(jìn)行可重現(xiàn)的 cDNA 合成。合成反應(yīng)可在15至30分鐘內(nèi)完成。RT-qPCR 用 Maxima 鏈 cDNA 合成試劑盒組分已預(yù)混合，因而可節(jié)省時(shí)間并減少可能出現(xiàn)的移液錯(cuò)誤。

Features

 

• 以寬范圍(0.01 pg – 5 μg)的起始RNA量可重復(fù)性地合成cDNA 。
• 提高了合成效率 – 15分鐘內(nèi)完成cDNA合成。
• 提高了反應(yīng)溫度 – 可高達(dá)60°C。
• 方便的設(shè)計(jì) – 預(yù)混合溶液以方便在RT-qPCR 中的應(yīng)用。

Applications

 

• 兩步 RT-qPCR。

說(shuō)明

Maxima® First Strａnd cDNA Synthesis Kit是一個(gè)適用于兩步實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)的優(yōu)化了cDNA合成的方便體系。該試劑盒采用了Maxima® Reverse Transcriptase，這是一個(gè)從M-MuLV RT進(jìn)化衍生出的高效逆轉(zhuǎn)錄酶。該酶具有高熱穩(wěn)定性，耐用性及提高的的合成率。Maxima® First Strａnd cDNA Synthesis Kit能以寬范圍(1 pg to 5 µg)的初始RNA量在提高的溫度下(50-60°C)可重復(fù)性地合成cDNA。合成反應(yīng)能在15-30分鐘內(nèi)完成。

Maxima® First Strａnd cDNA Synthesis Kit的組分對(duì)于RT-qPCR的使用者來(lái)說(shuō)非常方便。試劑盒的成分是預(yù)混合好的以節(jié)省時(shí)間和降低可能的移液錯(cuò)誤。試劑盒組分包括Maxima® Enzyme Mix, 5X Reaction Mix, 水（不含核酸酶)。

Maxima® Enzyme Mix 包含Maxima®逆轉(zhuǎn)錄酶和RiboLock™核糖核酸酶抑制劑。重組的RiboLock™抑制劑有效地保護(hù)RNA模板在溫度高至55°C的范圍內(nèi)不被RNases A、B 和 C降解。

5X Reaction Mix 包含了余下的反應(yīng)組分：反應(yīng)緩沖液，dNTPs, oligo (dT)₁₈ 和隨機(jī)引物六聚體。

Water, nuclease-free 適用于反應(yīng)體系的搭建和樣品RNA 的稀釋。它已經(jīng)通過(guò)測(cè)試不含有核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶。

 

質(zhì)量控制

已在在兩步RT-qPCR中進(jìn)行了功能測(cè)試，即以不同起始量(5 ng-0.5 fg)的 RNA為轉(zhuǎn)錄物逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及隨后的采用Maxima® SYBR Green/ROX qPCR Master Mix的擴(kuò)增反應(yīng)。效率在90-110%的范圍內(nèi)，斜率在-3.09 和 -3.58之間，相關(guān)系數(shù)>0.99。

 

組分

• Maxima® Enzyme Mix
• 5X Reaction Mix
• Water, nuclease-free
• 詳細(xì)的使用說(shuō)明

圖1。高靈敏度兩步RT-qPCR。
A – 擴(kuò)增圖。
B – 標(biāo)準(zhǔn)曲線。
基于Jurkat 細(xì)胞不同量的總RNA (5 μg, 2.5 μg, 1 μg, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg)的人PPP1CA 基因的擴(kuò)增。通過(guò)Maxima® First Strａnd cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR (#K1641)合成鏈cDNA。采用針對(duì)PPP1CA的TaqMan® 分析和Maxima® Probe /ROX qPCR Master Mix (2X) 擴(kuò)增鏈cDNA。反應(yīng)在ABI 7500 Real-Time PCR 儀器上操作進(jìn)行。1 pg 的總RNA被成功檢測(cè)出。反應(yīng)效率是105%，斜率為3.29，R² =0.999。

圖2。采用Maxima® First Strａnd cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR得到的可重復(fù)性的RT-qPCR 結(jié)果. 。
鏈的cDNA由100 ng-1 pg 的 Jurkat細(xì)胞總RNA 和Maxima® First Strａnd cDNA Synthesis Kit和從16個(gè)復(fù)制反應(yīng)中合成得到。合成出的cDNA在隨后的在ABI 7500 實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行的qPCR 反應(yīng)作為模板應(yīng)用。平行的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)顯示出以寬范圍RNA 起始量合成cDNA的可重復(fù)性和低變化性(<1% SD/Cq)。

圖3。Maxima® First Strａnd cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR的高產(chǎn)量和高靈敏度。
E.coli 23SRNA基因的擴(kuò)增基于10倍梯度稀釋的總RNA (30 ng to 3 fg)。鏈的cDNA 的產(chǎn)生采用了Maxima® First Strａnd cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR（紅色） 以及來(lái)自其他供應(yīng)商逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（藍(lán)色）。cDNA的擴(kuò)增采用Maxima® SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (#K0221/2/3)在ABI 7500 實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行。在采用了Maxima® First Strａnd cDNA Synthesis Kit的反應(yīng)，全部的起始RNA量(30 ng – 3 fg) 以較低的Cq 和102% 的反應(yīng)效率成功地檢測(cè)出。對(duì)照試劑盒沒(méi)有檢測(cè)出的3 fg 稀釋度的RNA且qPCR產(chǎn)物的產(chǎn)率也相對(duì)較低。