NobleRyder D9948 酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒Yeast Plasmid Extraction Kit

產(chǎn)品貨號(hào)：D9948

產(chǎn)品名稱(chēng)：酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒，Yeast Plasmid Extraction Kit

產(chǎn)品規(guī)格：50T/100T

酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒 蛋白提取

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

英文名稱(chēng)：Yeast Plasmid Extraction Kit

規(guī)格：50T ; 100T

儲(chǔ)存條件：酶附件-20℃，其它試劑RT，復(fù)檢期1年

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyder D9948 酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒，Yeast Plasmid Extraction Kit

產(chǎn)品介紹

本試劑盒采用酶法破碎酵母細(xì)胞壁和堿裂解法裂解酵母細(xì)胞來(lái)提取酵母質(zhì)粒DNA。所采用的酵母破壁酶能有效地破壞酵母細(xì)胞壁，提高酵母質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量。吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專(zhuān)一地吸附DNA，可最da限度去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。使用本試劑盒提取的酵母質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括酶qie、PCR、測(cè)序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)。本試劑盒無(wú)需使用酚、lu仿等有毒試劑，操作安全。

注意事項(xiàng)：

 1、溶液YP1在使用前先加入RNaseA(將試劑盒中提供的RNaseA全部加入)，混勻，置于2-8℃保存。

 2、第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說(shuō)明在漂洗液中加入無(wú)水乙醇配制成工作液(向15ml的漂洗液中加入60ml的無(wú)水乙醇)。

3、使用前請(qǐng)先檢查溶液YP2和溶液YP3是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。

4、溶液YP2、溶液YP3和漂洗液使用后應(yīng)立即蓋緊蓋子，如非指明，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)室溫下進(jìn)行離心。

5、質(zhì)粒得率與酵母菌株、質(zhì)粒拷貝數(shù)、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。通常酵母質(zhì)?？截悢?shù)都很低，因此質(zhì)粒得率一般為每5ml菌液提取1ug左右。

6、洗脫緩沖液的體積最好不少于50ul，體積過(guò)小會(huì)影響回收效率；洗脫液的pH值對(duì)洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。

操作步驟（僅供參考）：

1. 取 1-5mL 酵母培養(yǎng)物（不超過(guò)5×107cells）， 12000rpm 離心 1min，盡量吸除上清（菌液較 多時(shí)可以通過(guò)多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）。

2. 酵母細(xì)胞壁的破除：

A、酶法：向酵母菌體中加入470μL山li醇Buffer，充分懸浮菌體，加入25μL酵母破壁酶 和5μL巰基還原劑，充分混勻，30℃處理1-2h，期間可顛倒離心管混勻數(shù)次。12000rpm離心 1min，棄上清，收集沉淀。向沉淀中加入250μL YP1（請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA），充分懸浮沉淀。注意：如果菌塊未che底混勻，會(huì)影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。

B、玻璃珠法：向酵母菌體中加入250μL YP1（請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA），充分懸浮沉淀。加入150-200μL酸洗玻璃珠（自備），漩渦振蕩10min。簡(jiǎn)短離心使玻璃珠沉降到離心 管底，吸取上清（如上清有所損失，請(qǐng)用YP 1補(bǔ)足至250μL）于另一干凈離心管中。

3. 向離心管中加入250μL YP2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要 溫和，以免污染酵母基因組DNA，此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時(shí)間不要超過(guò)5 min，以 免質(zhì)粒受到破壞。

4. 向離心管中加入350μL YP3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮 狀沉淀。12000rpm離心20 min，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中，盡量 不要吸出沉淀。注意：YP3 加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白 色沉淀，可再次離心后取上清。

5. 取上一步上清，加入0.4倍體積無(wú)水乙醇，充分混勻。（體積過(guò)多可分兩次混合，然后上柱）

6. 將上一步所得上清液加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min，倒掉收集管中 的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7. 向吸附柱中加入600μL漂洗液Ⅰ(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心1min， 倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

8. 向吸附柱中加入 600μL 漂洗液ⅠⅠ(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm 離心 1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

9. 重復(fù)操作步驟8。

10. 12000rpm 離心 2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中 殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR等。

11. 將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50-200μL經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的 洗脫液，室溫放置2min，12000rpm離心1min。

12. (可選)為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置2min， 12000rpm 離心1min。

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