葡萄糖-6-磷酸(Glucose 6-phosphate， 6P G)含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100 管/48 樣

葡萄糖-6-磷酸含量測(cè)定試劑盒 糖酵解

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

6PG (Glucose-6-phosphate，葡萄糖-6-磷酸，又稱 6-磷酸葡萄糖)，是糖酵解和磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物，廣泛存在于動(dòng)植物體和微生物中。在糖酵解的第一步反應(yīng)中，葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸，然后通過(guò)磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的催化形成果糖-6-磷酸，以繼續(xù)糖酵解的其它步驟；而在戊糖磷酸途徑中，葡萄糖-6-磷酸是其第一個(gè)底物，該過(guò)程也是生成 NADPH 的主要途徑。此外，葡萄糖-6-磷酸也能轉(zhuǎn)化形成糖原或淀粉而被儲(chǔ)存起來(lái)。

測(cè)定原理：

6-磷酸葡萄糖脫氫酶可催化 6PG 和NADP⁺生成 6 磷酸葡萄糖酸和NADPH，NADPH 在 1-mPMS 的作用下使WST-8 顯橙黃色，在 450 nm 下測(cè)定吸光值。

組成：

自備儀器和用品：

酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96 孔板、研缽、冰、蒸餾水。

6PG 提?。?/span>

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）， 8000g，25℃離心 10min，取上清待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，8000g，25℃離心 10min，取上清待測(cè)。

3、血清（漿）等液體樣品：直接測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 450nm。

2、試劑二的配制：臨用前加入 3ml 水充分溶解待用，用不完的試劑分裝后-20℃保存；

3、工作液的配制：臨用前按照樣本數(shù)量，按以下比例配制工作液

樣本測(cè)定

按下表在 96 孔板中加入如下試劑

37℃避光孵育 30min，450nm 下測(cè)定吸光值 A 測(cè)定與A 對(duì)照，△A=A 測(cè)定-A 對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

6PG 含量計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 3.8589x - 0.0016，R2 = 0.997； x 為 6PG 含量（μmol/ml），y 為吸光值。

2、按照血清（漿）體積計(jì)算

6PG 含量（nmol/ml）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷V1×1000

=259.1×(△A+0.0016)

3、按照蛋白濃度計(jì)算

6PG 含量（nmol/mg prot）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷(V1×Cpr)×1000

=259.1×(△A+0.0016) ÷Cpr

4、按照樣品質(zhì)量計(jì)算

6PG 含量（nmol/g 鮮重）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷(W ×V1÷V2）×1000

=259.1×(△A+0.0016) ÷W

3、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

6PG 含量（nmol/104 cell）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷（500×V1÷V2）×1000

=0.518×(△A+0.0016)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05ml；V2：加入提取液體積，1 ml； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)；1000，μmol 到nmol 的換算系數(shù)。

葡萄糖-6-磷酸含量測(cè)定試劑盒 糖酵解