結(jié)合態(tài)淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase，GBSS）試劑盒說明書

分光光度法

結(jié)合態(tài)淀粉合成酶試劑盒

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

GBSS（EC 2.4.1.21）以束縛態(tài)存在于淀粉體中，催化淀粉鏈的加長反應，主要負責直鏈淀粉的合成。

測定原理：

GBSS 催化ADPG 與淀粉引物(葡聚糖)反應,將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上，同時生成 ADP；進一步通過反應體系中添加的丙tong酸激酶、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化 NADP+還原為NADPH，其中NADPH 生成量與前一步反應生成的ADP 數(shù)量呈正比，通過 340nm 下測定NADPH 的增加量，可以計算GBSS 活性。

組成：

BM6003-25T/24S 試劑二臨用前加入 7ml 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

BM6003-25T/24S 試劑三臨用前加入 4ml 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

BM6003-25T/24S 試劑四臨用前加入 9ml 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

BM6003-25T/24S 試劑五臨用前加入 0.5ml 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

BM6003-25T/24S 試劑六臨用前加入 0.5ml 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

BM6003-50T/48S 試劑二臨用前加入 14ml 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

BM6003-50T/48S 試劑三臨用前加入 8ml 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

BM6003-50T/48S 試劑四臨用前加入 17ml 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

BM6003-50T/48S 試劑五臨用前加入 1ml 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

BM6003-50T/48S 試劑六臨用前加入 1ml 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

自備儀器和用品：

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、移液器、1 ml 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液制備：

稱取 0.1~0.2g 組織（建議稱取約 0.1g 組織），加入 1ml 提取液，冰浴中勻漿。10000g ，4℃離心 10min，棄上清，在沉淀中加入 1ml 提取液充分混勻，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、在EP 管中按順序加入下列試劑

混勻，30℃保溫 20 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻

混勻，30℃保溫 30 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻，10000g 4℃離心 10min，取上清液（如果一次性測定樣本較多，可將試劑四、五和六按比例配成混合液）

混勻后立即 340 nm 波長下記錄初始吸光度A1 和 2min 后的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。

注意：試劑二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混勻。

GBSS 活性計算：

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

GBSS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T×稀釋倍數(shù)

=529×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按照樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

GBSS 活性（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T×稀釋倍數(shù)

=529×ΔA÷W

V 反總：反應體系總體積，7.8×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.15 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.9；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量。

結(jié)合態(tài)淀粉合成酶試劑盒