淀粉磷酸化酶（Starch phosphorylase，SP）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

淀粉磷酸化酶試劑盒 淀粉系列

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

淀粉磷酸化酶（Starch Phosphorylase，SP）是淀粉代謝過程唯yi的可逆反應(yīng)酶，既可催化淀粉的合成，也可催化淀粉的分解。

在高等植物中，淀粉磷酸化酶（合成方向）主要存在于質(zhì)體中，負責(zé)延長淀粉的 α-1,4-葡萄糖鏈的非還原末端；淀粉磷酸化酶（分解方向）主要存在于細胞質(zhì)基質(zhì)中，催化淀粉中的α-1,4-糖苷鍵磷酸解產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸，負責(zé)葡萄糖鏈的磷酸解，是淀粉代謝過程中的關(guān)鍵酶。

在植物體中，淀粉磷酸化酶分解方向的底物無機磷濃度比合成方向的底物葡萄糖-1-磷酸濃度幾乎高了兩個數(shù)量級，一般認為淀粉磷酸化酶只催化淀粉的分解，因此，分解方向的淀粉磷酸化酶具有重要測定意義。

測定原理：

淀粉磷酸化酶催化淀粉中的α-1,4-糖苷鍵與無機磷反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸，葡萄糖-1-磷酸在磷酸葡萄糖變位酶的作用下產(chǎn)生葡萄糖-6-磷酸，并在 6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化下還原 NADP+產(chǎn)生NADPH，使 340nm 下吸光值增加。

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 3ml 水溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存；試劑三：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 3ml 水溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1ml 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液）進行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃，離心 10min，取上清待測。

2、細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 10000g， 4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零；

2、工作液的配制：臨用前將試劑一、試劑二、試劑三按照每個樣本 850μL:50μL:50μL 的比例混合，臨用前配制，半小時內(nèi)使用。

3、在 1ml 石英比色皿中加入 50μL 樣本和 950μL 工作液，立即混勻，記錄 340nm 處 1min 時的吸光值A(chǔ)1和 6min 時的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A2-A1。

SP 活力單位的計算：

按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmolNADPH 定義為一個酶活力單位。

SP（nmol/min/mgprot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr)÷T

=943×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算

單位定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmolNADPH 定義為一個酶活力單位。

SP（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=943×ΔA÷W

按樣本細胞計算

單位定義：每萬個細胞每分鐘產(chǎn)生 1nmolNADPH 定義為一個酶活力單位。

SP（nmol/min/104cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(細胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

=1.886×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.05ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時間，5min；Cpr：樣本蛋白質(zhì) 濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；細胞數(shù)量，500 萬。

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