果膠酶（pectinase）試劑盒說明書

微量法 100T/48S

果膠酶pectinase試劑盒

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

果膠酶（pectinase）是一類分解果膠質(zhì)酶類的總稱，包括原果膠酶，果膠酯酶，多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶四大類，廣泛存在于植物果實和微生物中，主要用于食品、釀酒、環(huán)保、醫(yī)藥、紡織及日化用品行業(yè)。

測定原理：

果膠酶水解果膠生成半乳糖醛酸，具有還原性醛基，與 DNS 試劑反應生成紅棕色物質(zhì)，在 540nm 有特征吸收峰，測定 540nm 處吸光值變化可計算得果膠酶活性。

試劑組成和配制：

試劑二：粉劑×2 瓶，4℃保存；臨用前加入 7.5ml 試劑一，50℃加熱溶解，用不完的試劑 4℃保存一周。

需自備儀器和用品：

天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、恒溫水浴鍋。

酶液提?。?/span>

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 10000g， 4℃離心 10min，取上清置于冰上待測。

3、細胞培養(yǎng)液等：直接檢測。

測定步驟：

50℃水浴溫育 5min

混勻，50℃水浴反應 30min

沸水浴 5min，冰浴冷卻終止反應，8000g，4℃，離心 10min，蒸餾水調(diào)零，取上清于微量石英比色皿或 96 孔板測定 540nm 處吸光值A，△A=A 測定管-A 對照管。每個測定管需設一個對照管。

注意事項：

1、試劑二若有沉淀析出，請置于 50℃加熱溶解。

2、測定之前請先做預實驗，如果吸光值較高或較低，請用提取液做適當?shù)南♂尰蛘呒哟髽颖玖?，并在計算公式中乘以稀釋倍?shù)或者以實際加入的樣本體積參與計算。

煮沸樣本建議在沸水中煮沸 10 分鐘，以將酶che底滅活。

酶活性計算公式：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線：y = 3.9642x - 0.008；R2 = 0.9996；x 為標準品濃度，mg/ml；y 為吸光值。

按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在 50℃，pH3.5 條件下，每毫克蛋白每小時分解果膠產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h/mg prot）= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：在 50℃，pH3.5 條件下，每克樣本每小時分解果膠產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /g 鮮重）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷W

按細胞數(shù)量計算

酶活性定義：在 50℃，pH3.5 條件下，每 104 細胞每小時分解果膠產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /104cell）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V 反總÷（V 樣×細胞數(shù)量÷V 樣總）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷細胞數(shù)量

細胞培養(yǎng)液

酶活性定義：在 50℃，pH3.5 條件下，每毫升培養(yǎng)液每小時分解果膠產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /ml）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V 反總÷V 樣÷T=2.523×(ΔA+0.008)

V 反總：反應總體積，0.15ml；V 樣：反應中樣本體積，0.03ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應時間，0.5h

用 96 孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y = 1.9821x - 0.008，R2 = 0.9996；x 為標準品濃度，mg/ml；y 為吸光值。

按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在 50℃，pH3.5 條件下，每毫克蛋白每小時分解果膠產(chǎn)。生 1mg 半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h/mg prot）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：在 50℃，pH3.5 條件下，每克樣本每小時分解果膠產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h/g 鮮重）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷W

按細胞數(shù)量計算

酶活性定義：在 50℃，pH3.5 條件下，每 104 細胞每小時分解果膠產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /104cell）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V 反總÷（V 樣×細胞數(shù)量÷V 樣總）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷細胞數(shù)量

細胞培養(yǎng)液

酶活性定義：在 50℃，pH3.5 條件下，每毫升培養(yǎng)液每小時分解果膠產(chǎn)生 1mg 半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h/ml）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V 反總÷V 樣÷T=5.045×(ΔA+0.008)

V 反總：反應總體積，0.15ml；V 樣：反應中樣本體積，0.03ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應時間，0.5h

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