單脫氫抗壞血酸還原酶（monodehydroasorbate reductase，MDHAR）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

單脫氫抗壞血酸還原酶試劑盒

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

MDHAR 催化MDHA 還原生成AsA，在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。

測定原理：

MDHAR 催化 NADH 還原MDHA 生成 AsA 和NAD⁺，NADH 在 340 nm 有特征吸收峰，但是 NAD⁺沒有。通過測定 340 nm 光吸收下降速率，來計算出 MDHAR 活性。

組成：

試劑三：粉劑×1 瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入 5ml 蒸餾水充分溶解。試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 5ml 蒸餾水充分溶解。

試劑五：液體 25μl×1 瓶，4℃保存。臨用前加 5ml 試劑二充分溶解。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺式離心機(jī)、紫外分光光度計、1ml 石英比色皿、可調(diào)式移液槍和雙蒸水

粗酶液提?。?/span>

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；8000g ，4℃離心 20min，取上清液置冰上混勻待測。

血清等液體：直接測定。

MDHAR 測定操作：

分光光度計預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 340 nm，蒸餾水調(diào)零。

試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱 30 min。

依次在比色皿中加入 100μl 試劑三、100μl 試劑四、100μl 試劑五和 600μl 試劑二，最后加入 100μl 上清液，迅速混勻后于 340nm 比色，記錄 30s 和 150s 的吸光值A(chǔ)1 和A2，△A=A1-A2。

MDHAR 活性計算公式：

按蛋白濃度計算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位。

MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×109]÷（Cpr×V 樣）÷T

= 804×△A ÷Cpr

按樣本質(zhì)量計算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1U。 MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×109]÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T= 804×△A ÷W

按細(xì)胞數(shù)量計算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每 104 個細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位。

MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反總×109÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）÷T

= 804×△A ÷ 細(xì)胞數(shù)量

按液體體積計算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫升液體每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位。

MDHAR (nmol/min /ml) = △A÷ε÷d×V 反總×109÷V 樣）÷T

= 804×△A

ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，1ml=0.001 L， V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μl=0.1ml；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/ml，蛋白質(zhì)濃度需要另外測定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量 BCA 試劑盒；V 樣總：加入提取液體積，1ml；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，2min。

注意事項(xiàng)：

臨用前配制的試劑未使用完的 4℃保存，3 天內(nèi)使用完。

單脫氫抗壞血酸還原酶試劑盒