諾博萊德 微量/臨床基因組DNA快速提取試劑盒

臨床基因組DNA快速提取試劑盒（離心柱型）

目錄號：40215

  適用范圍：

適合于從微量血液、法醫(yī)材料、干血點、藥簽等微量樣品中分離純化基因組DNA。

試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性：

本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果  

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

儲存事項：

1. 結(jié)合液CB或者抑制物去除液IR低溫時可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。

2.   為避免降低活性，方便運輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，加入1毫升滅菌水溶解。因為反復(fù)凍融可能會降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分裝凍存，－20℃保存。

3.   Carrier RNA收到時為凍干粉狀，使用前按照注意事項4配制和儲存。

4.   避免試劑長時間暴露于空氣中發(fā)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子。仔細閱讀注意事項4。

產(chǎn)品介紹：

本試劑盒采用特制的進口DNA吸附柱和獨te的緩沖液系統(tǒng)，特別適合于從微量血液、法醫(yī)材料、干血點、藥簽、口香糖、尿液等微量樣品中分離純化基因組DNA。各種來源樣品裂解消化處理后DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜（特別配備了Carrier RNA可以從體系中輕松捕獲微量核酸），再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，將鹽、細胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈的基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。純化后的DNA無雜質(zhì)和PCR抑制劑，可直接適用于PCR分析。

產(chǎn)品特點：

1.        不需要使用有毒的ben酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。

2.        節(jié)省時間，簡捷，單個樣品操作一般可在20分鐘內(nèi)完成。

3.        配備了Carrier RNA用于充分收集特別微量DNA。

4.        多次柱漂洗確保高純度，提取的DNA 純度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠，可適用于各種常規(guī)操作，包括PCR、酶切、測序、Southern雜交等。

注意事項：

1.        所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達到13,000rpm的傳統(tǒng)臺式離心機，如Eppendorf 5415C或者類似離心機。

2.        開始實驗前將需要的水浴先預(yù)熱到所需溫度備用。部分樣品需要準備1M DTT。

3.        結(jié)合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作時戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

4.        Carrier RNA ：

1)   Carrier RNA收到時為凍干狀，使用時加入310μl RNase free 水充分溶解，配制成1μg/μl 溶液。Carrier RNA溶液應(yīng)避免反復(fù)凍融，凍融次數(shù)不能超過3次。所以建議在第一次使用時按自己每次的用量分裝在RNase-free的離心管中后置于－20℃儲存。

2)   Carrier RNA使用方法：如果起始處理量很少（例如小于10μl全血和法醫(yī)樣品），我們推薦使用Carrier RNA，如果預(yù)期有較大量DNA產(chǎn)量，用戶可以根據(jù)需要選擇是否加入Carrier RNA。使用時在每個樣品提取所需結(jié)合液CB中加入1μl Carrier RNA儲存溶液， 將結(jié)合液CB與Carrier RNA溶液充分顛倒混勻即可(結(jié)合液CB容易起泡沫,請勿使用渦旋振蕩混勻)。也可根據(jù)樣品數(shù)量，在總共需要的結(jié)合液CB中加入總共需要的Carrier RNA混勻備用?；旌弦涸谑覝?4小時內(nèi)穩(wěn)定。

3)   Carrier RNA加入過多造成DNA洗脫液中Carrier RNA濃度過高，下游PCR反應(yīng)可能受干擾，加入過少可能并不能幫助提高DNA產(chǎn)量和PCR敏感度，因此加入量應(yīng)該在具體試驗中調(diào)整以得到優(yōu)良效果。

4)   由于Carrier RNA本身是小核酸，所以得到的基因組測定OD260值會比真實值偏大，建議將得到的基因組直接用PCR 進行檢測。

操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）

提示：第一次使用前請先在15ml漂洗液WB中加入60ml無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!

1.        血液樣品

a.        取1-100μl血液到1.5ml 的離心管中。

b.        如果不足100μl，加入裂解液ML補足到100μl。

c.        加入10μl的蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，再加入100μl結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70℃放置10分鐘。

如果處理樣品<10μl,建議在100μl結(jié)合液CB 中加入1μlCarrier RNA儲存溶液。

d.        冷卻后加入50μl無水乙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，室溫放置3分鐘。

如果周圍環(huán)境高于25℃,乙醇需要冰上預(yù)冷后再加入。

e.        接操作步驟項下7。

2.        干血點

a.        用打孔機打孔的方法在血卡(上面有干血點)上沖取3mm(1/8英寸)直徑血卡小片(上面有干血點),最多將3個直徑3mm血卡小片放入1.5ml的離心管中。

一般血液應(yīng)該點在特定紙或者血卡上面干燥,如903 paper or IsoCode paper (Schleicher & Schuell), BloodstainCard or FTA Card (Whatman), Guthrie test cards, or comparable blood cards.

b.       加入180μl裂解液ML。

c.       加入20μl的蛋白酶K (20mg/ml)溶液，立刻渦旋振蕩充分混勻。

d.       56℃軌道搖床上面900rpm振搖1小時。

如果沒有可加熱軌道搖床，可以在水浴或者heating block上面進行，每10分鐘渦旋振蕩10秒幫助裂解。

e.       加入200μl結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻。

如果只處理一個3mm血卡小片，建議在200μl結(jié)合液CB中加入1μlCarrier RNA儲存溶液。

f.      70℃軌道搖床上面900rpm振搖10分鐘。

如果沒有可加熱軌道搖床，可以在水浴或者heating block上面進行，每3分鐘渦旋振蕩10秒幫助裂解。

g.      接操作步驟項下7。

3.       組織樣品

a.        新鮮或者解凍的組織在液氮中研磨成細粉后或者用解pao刀切成小碎塊（切成微塊可以提高產(chǎn)量）后取<10mg，轉(zhuǎn)入裝有180μl裂解液ML的1.5ml離心管中，用大口徑槍頭吹打混勻。

b.       加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。

c.       將裂解物放置在56℃水浴過夜或者直到組織消化完quan，期間輕柔的振蕩幾次幫助裂解。

對于小量的組織，一般4－6小時即可，但是過夜消化可以得到優(yōu)良結(jié)果。

d.        加入200μl結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻。

如果處理樣品量少,建議在200μl結(jié)合液CB中加入1μlCarrier RNA儲存溶液。

e.       冷卻后加200μl無水乙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，室溫放置5分鐘。

如果周圍環(huán)境高于25℃,乙醇需要冰上預(yù)冷后再加入。

f.        接操作步驟項下7。

4.        口香糖

a.        將30mg口香糖切成小塊放入1.5ml離心管，加入280μl裂解液ML和20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。

b.        56℃軌道搖床上面900rpm振搖至少3小時。

如果沒有可加熱軌道搖床，可以在水浴或者heating block上面進行，每10分鐘渦旋振蕩10秒幫助裂解。

c.        加入200μl結(jié)合液CB（加入1μl Carrier RNA），立刻渦旋振蕩充分混勻。

d.        70℃軌道搖床上面900rpm振搖1小時。

如果沒有可加熱軌道搖床，可以在水浴或者heating block上面進行，每10分鐘渦旋振蕩10秒幫助裂解。

e.        冷卻后加200μl無水乙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻。

f.   最高速（約14,000rpm）離心1分鐘，取上清加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。

g.        接操作步驟項下8。

5.        法醫(yī)材料

a1.      剪下1 cm2煙頭或者過濾嘴外層紙，切成6小塊放入1.5ml離心管，加入300μl裂解液ML和20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。接步驟b。

a2.      剪下0.5-2.5 cm2信封或者郵票，切成小塊放入1.5ml離心管，加入300μl裂解液ML和20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。接步驟b。

a3.       從毛發(fā)根部毛囊處開始剪下0.5-1 cm長度毛發(fā)放入1.5ml離心管，加入280μl裂解液ML和20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)和20μl 1M DTT溶液，立刻渦旋振蕩充分混勻。接步驟b。

a4.       將指甲剪成小塊放入1.5ml離心管，加入280μl裂解液ML和20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)和20μl 1M DTT溶液，立刻渦旋振蕩充分混勻。接步驟b。

a5.       將約0.5cm2信封沾染了血液、唾液、精液的材料剪成小塊放入1.5ml離心管，加入300μl裂解液ML和20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml) (如果是精液需另加入20μl 1M DTT溶液)，立刻渦旋振蕩充分混勻。接步驟b。

b.    56℃軌道搖床上面900rpm振搖1小時。

如果沒有可加熱軌道搖床，可以在水浴或者heating block上面進行，每10分鐘渦旋振蕩10秒幫助裂解。

一般毛發(fā)1小時裂解可以完成，如果不完quan可以延長時間。指甲等難裂解物建議過夜裂解。最后沒有裂解的不溶物在后續(xù)步驟e中會通過離心去除。

c.    加入200μl結(jié)合液CB（加入1μl Carrier RNA），立刻渦旋振蕩充分混勻。

d.    70℃軌道搖床上面900rpm振搖1小時。

e.    最高速（約14,000rpm）離心1分鐘，取上清加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。

f.    接操作步驟項下8。

6.        微切割樣品（包括福爾馬林固定的微切割樣品）

a.    加入15μl裂解液ML 到0.2 ml 離心管中，放入微切割樣品。

b.    加入10μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml) ，立刻渦旋振蕩充分混勻。

c.  56℃水浴3小時（福爾馬林樣品16小時）至裂解完quan，中間不時顛倒渦旋。

d.  加入15μl裂解液ML，再加入50μl結(jié)合液CB（加入1μl Carrier RNA），立刻渦旋振蕩充分混勻。

e.冷卻后加入50μl無水乙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，室溫放置5分鐘。

如果周圍環(huán)境高于25℃,乙醇需要冰上預(yù)冷后再加入。

f.接操作步驟項下7。

7.       將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。

8.        加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm離心30秒，棄廢液。

9.        加入500μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm離心30秒，棄掉廢液。

10.    加入500μl漂洗液WB，12,000rpm離心30秒，棄掉廢液。

11.   將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

12.  取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加20－50μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中預(yù)熱效果更好）， 室溫放置2-5分鐘，12,000rpm離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當減少洗脫體積，但是最小體積不應(yīng)少于20μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。

13.DNA可以存放在2-8℃，如果要長時間存放，可以放置在－20℃。

問題與解決方法

微量/臨床基因組DNA快速提取試劑盒