大家先看幾個耳熟能詳的數據：
每年有約400萬中國人死于吸煙引發(fā)疾病，超過因艾滋病、結核、交通事故及死亡的人數總和；
平均每6秒就有一個人死于吸煙有關疾病；
吸煙者的平均壽命要比不吸煙者縮短10年；
*每年因吸煙死亡人數高達700萬，其中89萬為常年吸食二手煙導致。
1究竟是什么讓吸煙如此有害健康？
吸煙者多死于肺癌，煙氣中常見的有害物苯并芘是一種高活性間接致癌物，屬于多環(huán)芳烴的一種。多環(huán)芳烴（簡稱PAHs）是人類早發(fā)現(xiàn)的一類環(huán)境有機致癌化合物，廣泛存在于煙熏燒烤類食品、香煙煙霧中，通過呼吸道、消化道和皮膚進入人體，參與體內代謝，生成羥基多環(huán)芳烴（OH-PAHs）。香煙煙霧作為多環(huán)芳烴的一個重要來源，是吸煙者（包括吸二手煙者）接觸多環(huán)芳烴的主要途徑。
圖1 非吸煙者（左）與吸煙者（右）肺部對比圖
2如何檢測人體內的多環(huán)芳烴（PAHs）？
目前，尿液中的OH-PAHs是研究多的人體對PAHs 的暴露水平綜合評價的生物標志物。但是尿液中多環(huán)芳烴代謝物的含量極低，且尿液成分較復雜，所含雜質可能對色譜柱造成損害，直接進樣不能滿足分析要求。而現(xiàn)有采用離線固相萃取技術來減少基質干擾，提高檢測靈敏度的方法，操作過程繁瑣費時，重現(xiàn)性較差，成本較高。
在線固相萃取（Online-SPE）是近年發(fā)展起來的一種全自動樣品前處理方式，具有富集純化一步完成、固相萃取柱可多次使用、重現(xiàn)性好、自動化程度高等優(yōu)點，已被應用于食品、環(huán)境、生物等樣品中痕量有機物的檢測。
賽默飛與“國家生物監(jiān)測”重點實驗室之一的上海疾病預防控制中心合作，開發(fā)了基于賽默飛雙三元液相色譜—在線SPE大體積進樣方法，實現(xiàn)人體尿液中多環(huán)芳烴羥基代謝產物的高靈敏度監(jiān)測。
“國家人體生物監(jiān)測項目”是國家衛(wèi)生計生委疾控局組織的國家重大公共衛(wèi)生服務項目，通過在全國開展現(xiàn)場流行病學調查和人體生物樣本中環(huán)境化合物檢測，獲得全國有代表性的環(huán)境化合物在人體內暴露負荷的基礎數據，為今后相關公共衛(wèi)生工作提供技術支持。
本方法采用基于快速渦流色譜的Turboflow Cyclone 固相萃取柱對目標尿樣進行在線富集純化，將大分子蛋白雜質提前分離去除，不僅延長了固相萃取柱使用壽命，而且進一步降低了交叉污染率。同時，采用UHPLC-MS法，利用PAHs 細粒徑UHPLC色譜柱對多環(huán)芳烴代謝物實現(xiàn)快速分離，解決了常規(guī)液相分離中部分目標物的出峰無法*分開和無法準確定性定量的問題，結合大體積進樣，大大提高了檢測靈敏度。
圖2 在線SPE大體積進樣系統(tǒng)工作原理圖
【進樣富集】
【轉移】
【分析過程】
實驗條件
富集柱：Turboflow Cyclone柱（50×0.5 mm）；
分析柱：PAH UHPLC柱（2.1x100 mm，1.8 μm）；
柱溫30℃；進樣量2500 μL；
流動相A：水，B：甲醇:乙腈（1:1）；
梯度洗脫程序表1；質譜條件：負離子電噴霧（ESI-）。
表1 梯度洗脫程序
表2 多環(huán)芳烴羥基代謝物的保留時間、檢測離子對和碰撞電壓
注：帶“*”為定量離子對。
檢測結果
通過使用Turboflow Cyclone富集柱和1.8 μm UHPLC細徑分析柱（2.1x100 mm），12種目標化合物能夠在短時間內快速分離，混合標準溶液的總離子流圖見圖3。標準物質的實驗結果顯示方法線性范圍廣（0.002~1.0 μg/L），線性較好，且回收率高（90%~110%），各目標物在尿液中的檢出限低可達到0.001 μg/L水平，各目標物的6次進樣結果RSD不超過5%，重復性較好。實驗采集了24個尿液樣本（9名兒童和15名成人，包括6名吸煙成人男性）進行分析，檢測結果顯示，吸煙者尿液中各種多環(huán)芳烴代謝物檢出量顯著高于非吸煙者（見表2）。
圖3 各多環(huán)芳烴羥基代謝物標準溶液的總離子流圖
表3 吸煙和非吸煙者尿液樣品中部分多環(huán)芳烴羥基代謝物測定結果
結論
本方法采用雙三元在線固相萃取前處理方法，大大簡化了樣品前處理過程，分析成本大為降低，樣品經固相萃取柱富集濃縮后在線轉移至分析柱進行分析，樣品中的待測組分能全部轉移至分析柱，樣品用量少且無損耗，采用質譜檢測器可獲得較高的靈敏度，可實現(xiàn)大批量樣品的自動、快速、檢測。
感謝上海疾病預防控制中心各位老師的辛勤工作，老師們用實驗數據再一次告訴我們：為健康，為家人，為自己，請拒絕吸煙！
關鍵詞：雙三元液相色譜；在線固相萃??；多環(huán)芳烴羥基代謝物；LC-MS
注：以上數據由上海疾病預防控制中心化學品毒性檢定所提供
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