道一聲珍重，道一聲珍重，那一聲珍重里有蜜甜的憂愁，在這里，我們?yōu)槭裁唇o了這個美麗的句子呢？因為我們這一期的主題是，蛋白質修飾中的一個很"甜蜜"的組學技術，也是蛋白質組學人"蜜甜的煩惱"，那就是糖組學和糖蛋白質組學。
我們知道，蛋白質的翻譯后修飾是蛋白質表征中的重要部分，因其極大的增加了蛋白質水平的復雜度，并且能夠提供超越基因水平的注釋信息。其中，糖基化修飾是蛋白質翻譯后修飾的重點、難點之一。與遵守中心法則的轉錄和翻譯不同的是，糖基化中糖鏈的合成沒有模板，是多酶聯合作用的結果，難以通過基因組、轉錄組或者蛋白質組學的數據進行預測，除了位點水平的宏觀不均一性外，同一個糖基化位點上可能存在多種糖型，稱之為微觀不均一性。因此，這也使得糖肽、糖鏈的豐度進一步被分割降低，檢測的難度進一步增加。
鑒于在糖肽的鑒定與定量研究中遇到的諸多困難，復旦大學陸豪杰教授團隊近日在《國家科學評論》（National Science Review, NSR）發(fā)表題目為High-throughput site-specific N-glycoproteomics reveals glyco-signatures for liver disease diagnosis的文章[1]，意在通過DMEN化學標記法與賽默飛HCD-pd-ETD的質譜采集技術，對人血清樣品中的完整糖肽進行高通量的定性與定量分析，并可通過糖標志物組合對不同肝臟疾病病程進行區(qū)分。
研究詳情
DMEN標記法，即基于N,N-dimethylethylenediamine(DMEN)標記的方法，可參照作者團隊于2019年發(fā)表的Chemical Science的文章[2]。
圖1：DMEN與糖肽的羧基端的反應
基于質譜表征的完整糖肽其痛點在于，復雜樣品中糖肽的含量較低且存在微觀不均一性，糖肽親水，帶電困難，且由于糖鏈和肽鏈的同時存在，碎裂能量多被糖苷鍵吸收等困難。隨著質譜技術的發(fā)展，ETD技術因能夠產生較好的鑒定糖肽肽段部分的碎片離子信息，逐漸成為鑒定糖肽的重要手段之一。為了更好的提升ETD的碎裂效率，本篇文章作者團隊開發(fā)的DMEN標記的方法有效提升多肽的帶電，提升的電荷數有利于下一步質譜中ETD的碎裂，得到更加豐富的c、z離子。本篇文章中，糖肽的質譜鑒定所用到的ETD碎裂模式，特指的是賽默飛三合一系列質譜儀所*的HCD-pd-ETD的模式。研究團隊應用DMEN+TMT標記+HCD-pd-ETD的方法，對收集的包括23例健康對照組、24例HBV感染組、22例CIR組和21例HCC組的共90例患者的血清樣品，使用前述的HTiGQs方法進行完整糖肽分析。實驗共鑒定到313條來自于IgG的完整N糖肽，這個數據是迄今報道的最大的人血清IgG亞類特異性和位點特異性的N糖肽數據集。糖肽的電荷數的增加，使得糖肽鑒定的譜圖中，鑒定到的糖肽的ETD譜圖高于HCD譜圖，而在ETD中鑒定到的譜圖98%的譜圖都同時有ETD譜圖。
圖2：高通量完整糖肽定量策略
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圖3：HCD-pd-ETD質譜采集技術
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在擁有了高質量的鑒定信息后，在定量研究策略中，作者在workflow的第一步使用了基于賽默飛TMT-10plex的標記策略，以實現對糖肽高準確度的定量；TMT (Tandem mass tag)技術是賽默飛研發(fā)的多肽體外等重同位素標記的相對與絕對定量技術，最高通量為18-plex，質譜檢測時可實現來源于不同的生物學樣品的的同一條多肽可實現色譜共洗脫，一級譜共隔離，并能在同一張二級譜上同時實現定性與定量。
圖4：TMT定量策略
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與非糖肽相比，糖肽的報告離子的強度偏低，這顯然不利于定量。有研究報道使用stepped NCE的方法，以20-30-40%的能量進行碎裂，可以在同一張譜圖中同時得到大量的糖鏈和肽鏈所產生的碎片離子信息。而我們知道，TMT需要更高的碰撞能量，這些能量可以大部分被糖苷鍵所吸收，報告離子強度低則會直接影響定量的準確性、重現性及靈敏度。基于此，作者探索了sceHCD-ETD, sceHCD-pd-ETD, and HCD-ETD不同能量的組合，從結果可以看出，HCD-pd-ETD的方法要優(yōu)于僅適用ETD碎裂，sceHCD-pd-ETD NCE 50 ± 10 的方法所鑒定到的糖肽數量最多，且碰撞能量的提高也可以提高TMT報告離子的強度，有利于定量。實驗結果中可以看到，利用不同混樣比例對TMT定量的準確性進行檢驗，實測ratio值與理論ratio值接近；N糖肽的TMT定量的高度的準確性與重現性，這使得在更復雜的大規(guī)模樣品中實現對N糖肽的定性定量成為可能。
圖5：TMT定量準確性
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為了進一步篩選出可以對疾病病程進行分類的糖肽，研究團隊從來源于不同肝臟疾病樣品的差異表達的糖肽的27個候選的糖肽中進行篩選發(fā)現， IgG1-H3N5F1 和IgG4-H4N3 可作為分辨肝病發(fā)生發(fā)展進程潛在的生物標志物。最后，作者還選取了7個在大多數臨床樣品中發(fā)現且具有代表性的差異表達的糖肽在驗證集（包含11例健康對照、12例HBV感染樣品、11例CIR組和11例HCC樣品）中進行了PRM方法的驗證。
圖6：肝臟疾病病程診斷的潛在的糖標志物的篩選（點擊查看大圖）
另，為驗證方法適用性，作者團隊還將HTiGQs方法應用于人血清糖蛋白質組學。每位受試者取10μl血清樣品，共鑒定了包含1961個unique N糖肽的168個糖蛋白。經DMEN標記后，可鑒定到更多的且電荷數更多、分子量更大的糖肽；而在聚糖類型方面，不同的模式具有不同的碎裂傾向，可對糖肽進行互補性的采集。
圖7：人血清中N-糖肽的鑒定
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肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、長期、復雜的動態(tài)過程。曾經的中國是乙肝大國，也是HCC高發(fā)區(qū)；目前，通過疫苗的普及及疾病的研究，2020年，中國也逐步實現了乙肝大國的“摘帽"。需要看到的是，目前乙肝仍然是中國面臨的嚴重的公共衛(wèi)生問題，我國的乙肝患者的絕對數量仍然很高，故關注乙肝感染引發(fā)的病程發(fā)展，減緩肝細胞癌的發(fā)生，改善患者的生存質量仍是我國廣大的醫(yī)藥工作者、科學家們的不懈追求。
參考文獻：
[1] Sun, Zhenyu, et al. "High-throughput site-specific N-glycoproteomics reveals glyco-signatures for liver disease diagnosis." National Science Review (2022).
[2] Yang, Lijun, et al. "Chemical labeling for fine mapping of IgG N-glycosylation by ETD-MS." Chemical science 10.40 (2019): 9302-9307.
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