在細胞實驗中，我們通常通過凍存的手段讓細胞代謝變得緩慢，從而達到長期保存或保種的目的，以供后續(xù)實驗的使用，那么如何讓細胞“凍”起來使之不變與永恒逐漸成為一個熱門話題，接下來一起來探究一下吧！

【低溫儲存】

隨著細胞被冷凍至冰點以下，懸液中冰晶和溶質(zhì)的濃度有所增加。如果冷卻過程中，胞內(nèi)水分可以滲出細胞，則可以減少胞內(nèi)冰晶。通常1℃/min的降溫速度可以促進此過程。但是，水分的喪失會導致細胞收縮，當這種收縮達到一定程度，又會導致細胞活性的劇烈下降。冷凍保護劑，如甘油或者二甲基亞砜（DMSO，貨號：D2650），可以緩解這種效應。細胞凍存的標準程序是在含有冷凍保護劑的培養(yǎng)基中，將細胞緩慢冷凍至–70℃，然后將凍存管轉移到液氮中以保持低于–130℃的環(huán)境。

【凍存液】

5%-10%的甘油和DMSO是最常見的凍存保護劑。雖然DMSO對細胞有毒性，但是與甘油相比，其滲入細胞的速度更快，而且凍存重復性更好（而且細胞復蘇效率更好）。但是，DMSO一方面會導致某些細胞（如HL-60早幼粒細胞）分化，另一方面對某些細胞（如HBE4-E6/E7肺上皮細胞）的毒性也過大。對于這些細胞，則應使用甘油。甘油可以通過高壓蒸汽滅菌，而DMSO只能通過過濾除菌。DMSO或者甘油至少應達到試劑級（或者更高級別，如細胞培養(yǎng)級），并且分裝，避光保存。

【凍存管】

凍存管材質(zhì)分為兩種：玻璃或者塑料。玻璃管更難操作，但更適合珍貴細胞的長期保存，而且一旦適當密封，其安全性也更高。

【程序降溫盒】

有很多方法可以實現(xiàn)1℃/min的降溫速度。電腦控制的可編程電子降溫系統(tǒng)是很好的方式，可以精確保持降溫速度。

比較經(jīng)濟的方式是將凍存管放置于凍存盒中，在低于–70℃的冰箱中凍存24小時。已有一些商業(yè)化凍存盒產(chǎn)品能夠非常接近1℃/min的理想降溫速度?；蛘呖梢詫龃婀芊胖糜诒诤翊蠹s15mm的1L容積的聚苯乙烯盒子中，并填充入紙、棉絨或者泡沫起到隔熱的作用。

【液氮罐凍存】

長期保藏所需要的超低溫（低于 -130℃）環(huán)境，可以使用低溫冰箱，更普遍的方法是保存在液氮罐中。液氮儲存分為兩種方式：將凍存管浸入液氮中或者懸于液氮液面以上的蒸氣中。液體體系需要更多的液氮，后期維護簡單，但是液氮有可能進入密封不嚴的凍存管中，并在細胞復蘇時發(fā)生凍存管爆炸。

因此，強烈建議保存在液氮蒸氣中。液氮蒸氣會在罐內(nèi)產(chǎn)生一個垂直的溫度梯度。液氮底層為-196℃，而上層溫度會受到液氮余量和液氮罐敞開時長的影響。為保證儲存安全，請確保罐中液氮充足，以使上層溫度低于-130℃。所有的儲存系統(tǒng)都應配備溫度報警裝置。

【凍存程序】

以下程序適用于大多數(shù)細胞，如果必要，可以適當調(diào)整。凍存培養(yǎng)基的配方請參考其細胞說明書。

1.凍存前先檢測細胞是否受到細菌、真菌、支原體和病毒的污染。通常凍存后10-14天才能得到污染檢測結果，如果確定有污染，應將該細胞銷毀。

2.凍存培養(yǎng)基由wan全培養(yǎng)基和5% DMSO（sigma D2650）組成。由于DMSO的溶解會放熱，所以不能向細胞懸液中直接加入未稀釋的DMSO。

3.以溫和速度（125g×10 min）離心收集細胞，并以1×10*6-5×10*6活細胞/ml的密度重懸細胞。繼續(xù)培養(yǎng)細胞直到復蘇后細胞活性得以確定。

4.在凍存管上標記好細胞名稱，編號和凍存日期等信息。然后每管加入1-1.8 ml細胞懸液（視凍存管體積）并密封。

5.室溫條件下，將細胞在凍存培養(yǎng)基中平衡15-40 min（勿超）。這段時間中，可以將細胞懸液等分加入凍存管中。40min后，細胞活性可能會受到DMSO的影響而下降。

6.將凍存管置于已預冷至4℃的程序降溫盒，并將降溫盒置于-70℃（或更冷）的冰箱中至少24小時?；蛘?，使用已預冷至4℃的可編程電子降溫系統(tǒng)以1℃/min的速度將凍存管降溫至-40℃以下，然后迅速降至-130℃。

7.將凍存管迅速轉移至液氮罐或者-130℃冰箱。通常，冷凍的細胞會以10℃/min的速度升溫，一旦達到-50℃以上，細胞會劇烈受損。

8.記錄凍存位置和過程細節(jié)等信息。

9.置于-130℃ 24小時后，取出一只凍存管并復蘇，以測定細胞活性和是否污染。

本期內(nèi)容：如何讓細胞“凍”起來？

下期內(nèi)容：細胞實驗中為什么要“慢凍快融”呢？