層粘連蛋白521（LN521）是天然干細胞生態(tài)位的關(guān)鍵細胞粘附蛋白，是一種用于人胚胎（hES）和誘導多能干細胞（hiPSC）培養(yǎng)和擴增的基質(zhì)。LN521與細胞表面受體結(jié)合，激活細胞信號通路，從而產(chǎn)生更多功能性細胞。

Laminin 521在體外重現(xiàn)生物學相關(guān)的hPSC環(huán)境，促進hPSC的附著、高存活和強大的長期自我更新，是支持干細胞生長以及維持基底膜結(jié)構(gòu)和性能穩(wěn)定的關(guān)鍵基質(zhì)蛋白。Laminin 521也是目前常用的無滋養(yǎng)層培養(yǎng)基質(zhì)之一。此外，Laminin 521無需添加任何細胞凋亡抑制劑，即可實現(xiàn)遺傳穩(wěn)定和多能干細胞的高效單細胞傳代，細胞以均勻單細胞層生長，無需手動去除任何分化區(qū)域。另外，研究表明LN521可支持PSC生長超過10代，且無任何核型異常跡象，并且保持PSC分化為內(nèi)、中、外三個胚層的能力。

圖1.Laminin 521結(jié)構(gòu)[1]

1.1  將 iPSC 從液氮或干冰中取出 ，在 37°C水中解凍10 秒。

1.2  用75％酒精對冷凍管進行消毒，并將其轉(zhuǎn)移到工作臺面上。

1.3  將細胞轉(zhuǎn)移到一個新15 mL離心管中，離心管中含有9 mL DMEM?F12。

1.4  將15 mL離心管在室溫下以300g離心5min。

1.5  將已包被好的12孔板中的層粘連蛋白溶液棄去。

1.6  棄去細胞上清液，用1 mL  mTeSR-plus（含10 µM Y-27632 ）輕輕重懸 iPSC，然后將其轉(zhuǎn)移到已包被好的12孔板中。搖動板以均勻分布細胞，最終細胞密度為1×10^5細胞/孔，靜置，室溫下放置10分鐘。確保培養(yǎng)在4~5天內(nèi)傳代。

表2.不同培養(yǎng)容器的細胞接種密度，根據(jù)細胞的生長速度確定細胞數(shù)量

1.7 將12孔板放回37°C培養(yǎng)箱孵育。

1.8 含ROCK抑制劑的培養(yǎng)基應(yīng)在12~16小時后除去，繼續(xù)在不含抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

2.1 棄去培養(yǎng)上清，用1 mL PBS(Ca??/Mg??)沖洗。

注意：使用不含Ca2+ 和 Mg2+的PBS，因為二價陽離子對某些解離酶有負面影響。

2.2 棄去PBS，加入0.5 mL Gentle Cell Dissociation Reagent。室溫下放置6-8分鐘或放在顯微鏡下觀察，直至細胞不再結(jié)合到板上。

2.3 加入等體積的DMEM-F12，輕輕混勻細胞，在室溫轉(zhuǎn)移到離心管中，以300g離心5min。

2.4 在傳代細胞前，準備一個層粘連蛋白包被的12孔板。

2.5  棄去上清液并用含有 10  µM  Y?27632  的 mTeSR?plus 培養(yǎng)基重新懸浮細胞。

2.6 將細胞轉(zhuǎn)移到準備好的層粘連蛋白包被的12孔板中。輕輕搖動板以均勻分布細胞，并室溫下放置10至20分鐘。

2.7將12孔板放入37℃培養(yǎng)箱中孵育。

注意：ipsc長成單層后會迅速分化并死亡。為了保持生長和多能性，需在其長滿前進行傳代。

3.1 準備好溫和細胞解離試劑。
3.2 按照ipsc傳代方案進行細胞分離，使用細胞器計數(shù)，確保冷凍保存前的細胞密度。
3.3 每管細胞應(yīng)以1-2×10^6細胞密度凍存。按照ipsc傳代方案中，離心、取出細胞培養(yǎng)基的步驟進行。將分離的iPSC沉淀重懸于適當體積的冷凍保存液中。
3.4 將1 mL 重懸的細胞冷沉淀加入1.5mL凍存管中，進行程序降溫，然后轉(zhuǎn)移到到液氮中，長期儲存。

1.實驗方案中的所有步驟均須在無菌條件下執(zhí)行。
2.避免層粘連蛋白長時間暴露在室溫下。
3.應(yīng)避免反復凍融
4.解凍后，未稀釋的蛋白原液在無菌條件下儲存于 2~8℃保存，可穩(wěn)定保存至少3 個月。