1. 清潔樣品表面

對于每種細胞計數方法，樣品表面必須清潔。任何污染都可能導致結果不準確。手動細胞計數包括移除和清潔玻璃蓋玻片，然后用 70% 乙醇和水清潔計數室。使用一次性塑料載玻片時，每個樣品（如果載玻片有兩個腔室，則為一對樣品）都需要一張新的載玻片。

使用 CellDrop 系列儀器，腔室在兩個彼此平行的光學級藍寶石表面之間形成。樣品在表面之間移液，并通過表面張力固定到位。要清潔表面，只需用干燥的實驗室濕巾擦拭即可。

如需進一步清潔，用 15 μL 70% 乙醇或 10% 漂白劑沖洗腔室。加載后，讓溶液靜置 ~10 秒，然后用實驗室干抹布清潔表面。

2. 加載前立即混合

在加載樣品之前立即混合對于確保分析樣品的代表性至關重要。

不同大小和類型的像元將以不同的速率沉降和聚集。在上樣前立即混合溶液可增加等分試樣均勻并準確反映細胞培養(yǎng)物特性的可能性。

3. 減少細胞聚集

細胞計數需要分析整個儲備液中的少量樣品，因此必須注意確保樣品具有原始儲備培養(yǎng)物的代表性。雖然像 CellDrop 這樣的細胞計數儀應用算法來識別團塊中的細胞，但它們無法校正不具有代表性的樣品。手動計數時，團塊的評分比單個細胞更主觀，這增加了用戶之間的可變性。

細胞裂解后的細胞外 DNA 和細胞碎片是結塊的常見原因。細胞裂解可能是由過度生長、過度移液造成的機械剪切、凍融循環(huán)以及胰蛋白酶消化不足或過度引起的，也可能導致樣品異質性。通過避免細胞裂解的原因和過濾樣品中的細胞碎片，可以減少細胞團塊。

4. 優(yōu)化設置

無論是手動計數還是依靠軟件算法進行計數，調整對焦和曝光設置以確保細胞的最佳可見性以獲得最準確的結果都很重要。

最佳對焦和曝光將顯示細胞膜和背景之間的鮮明對比。

針對熒光應用單獨優(yōu)化每個熒光通道的能力將產生最可重現的結果。應設置熒光強度以確保細胞在保持其實際大小的同時盡可能明亮。光線不應滲過細胞的邊緣。

5. 使用適當的腔室高度

有一系列血球計數器可供選擇，深度和網格設計各不相同。請注意在計算中使用正確的詳細信息以避免錯誤。

CellDrop 具有一定的功能，與其他基于玻片的計數儀相比，可實現更寬的細胞密度范圍。裝載室高度可通過軟件進行調整，以適應最寬的細胞密度和粒徑范圍。提供屏幕指導以確保最佳高度，并自動調整計算。

6. 調整計數參數

大多數自動細胞計數儀都包含可調整的設置，以最好地匹配正在研究的細胞。例如，可以設置并保存像元大小范圍，以從分析中排除碎片或其他像元群。

還提供了用于定義單元格形狀的設置。對于 CellDrop，可以在細胞計數之前或之后調整設置，并根據新參數重新分析數據。

7. 選擇明場或熒光

明場分析可有效計數培養(yǎng)的哺乳動物細胞。然而，使用臺盼藍可能很難區(qū)分活細胞和死細胞，并且對于許多原代細胞，需要熒光。

例如，外周血單核細胞 （PBMC） 通常與大量紅細胞 （RBC） 混合，使用明場分析可能顯示為“死亡”。然而，使用吖啶橙 （AO） 和碘化丙啶 （PI） 等染料，可以僅對有核 PBMC 進行染色，并使用雙重熒光功能區(qū)分活體和死體。

AO 和 PI 都可以對核酸進行染色，但只有 AO 可以穿過活細胞膜。因此，活的 PBMC 用 AO 染色并發(fā)出綠色熒光，死的 PBMC 用 AO 和 PI 染色并發(fā)出紅色熒光。紅細胞未染色，根本不發(fā)出熒光。