百歐博偉生物：凡把兩個(gè)不同性狀個(gè)體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子間的重新重組合，形成新遺傳型個(gè)體的方式，稱為基因重組。重組可使生物體在未發(fā)生突變的情況下，也能產(chǎn)生新遺傳型的個(gè)體。

基因重組是雜交育種的理論基礎(chǔ)。由于雜交育種選用已知性狀的供體菌和受體菌作為親本。因此比誘變育種前進(jìn)了一大步。同時(shí)也可消除某一菌株長(zhǎng)期誘變導(dǎo)致產(chǎn)量上升緩慢現(xiàn)象。因此它是一種重要的育種手段。

原核微生物的基因重組

一、轉(zhuǎn)化 (transformation)

轉(zhuǎn)化是細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移形式。 l928 年 Griffith 用肺炎鏈球菌對(duì)小鼠的感染實(shí)驗(yàn)以及 10 多年后 Avery 等體外轉(zhuǎn)化過程的實(shí)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化因子 DNA 的證實(shí)，是現(xiàn)代生命科學(xué)發(fā)展的重要起點(diǎn)。

1、幾個(gè)概念

轉(zhuǎn)化 受體菌直接吸收了來自供體菌的 DNA 片段，通過交換把它整合到自己的基因組中，從而獲得了新的遺傳特性的現(xiàn)象。

轉(zhuǎn)化子（ transformant ） 受體細(xì)胞經(jīng)復(fù)制分裂后出現(xiàn)了供體性狀的子代。

感受態(tài) (competence) 細(xì)菌能夠從周圍環(huán)境中吸收 DNA 分子進(jìn)行轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。

2、轉(zhuǎn)化的條件

包括受體菌與外源 DNA 的條件。

受體菌 只有處于感受態(tài)的細(xì)菌才能吸收外源 DNA 實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。細(xì)菌的感受態(tài)是一種生理狀態(tài)，它可以通過感受態(tài)因子（細(xì)菌生長(zhǎng)到一定階段分泌一種小分子的蛋白質(zhì)）在細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移而獲得。這種感受態(tài)因子與細(xì)胞表面受體相互作用，誘導(dǎo)一些感受態(tài) -- 特異蛋白表達(dá)，其中一種是自溶素，它的表達(dá)使細(xì)胞表面的 DNA 結(jié)合蛋白及核酸酶裸露出來，使其具有與 DNA 結(jié)合的活性。

現(xiàn)在可用人工的方法提高受體菌感受態(tài)的水平，通過以 CaCl2 、 cAMP 等處理，后者可使感受態(tài)水平提高 10000 倍。

外源 DNA 必須具備兩個(gè)基本條件，即具有高相對(duì)分子質(zhì)量和同源性：①轉(zhuǎn)化 DNA 的相對(duì)分子質(zhì)量通常在 1 × 10 7 以下，約占細(xì)菌染色體組的 0.3 ％，否則活性喪失；多數(shù)研究中，基因轉(zhuǎn)移使用的是雙鏈線性 DNA ，某些單鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA 也可用于轉(zhuǎn)化；②親緣關(guān)系越近， DNA 的純度越高，則轉(zhuǎn)化率越高。

3、轉(zhuǎn)化過程

主要通過 3 個(gè)步驟完成。

感受態(tài)細(xì)胞的建立 可用人工方法提高受體菌的感受態(tài)水平，通常以 CaCl 2 、 cAMP 等處理菌體，后者可使感受態(tài)水平提日 l0 000 倍。

DNA 的結(jié)合和攝取 首先是供體雙鏈 DNA 與受體細(xì)胞壁上的接受位點(diǎn)相結(jié)合。此反應(yīng)的最初是可逆的，但隨著與細(xì)胞膜蛋白的進(jìn)一步作用，其與細(xì)胞壁的結(jié)合則變得十分穩(wěn)定而不可逆。隨后其中一條鏈被細(xì)胞表面上的核酸酶降解，降解產(chǎn)生的能量協(xié)助把另一條鏈推進(jìn)受體細(xì)胞。亦發(fā)現(xiàn)有完整的雙鏈被攝取的情況，如革蘭氏陰性菌——嗜血桿菌。

轉(zhuǎn)化因子與染色體重組 當(dāng)單鏈進(jìn)入受體細(xì)胞后，便與雙鏈結(jié)構(gòu)的受體染色體 DNA 同源片段發(fā)生交換重組。即與受體菌 DNA 整合，形成供體 DNA-- 受體 DNA 復(fù)合物，再通過 DNA 復(fù)制和細(xì)胞分裂而表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化性狀，形成轉(zhuǎn)化子。

能夠發(fā)生轉(zhuǎn)化的微生物有：肺炎鏈球菌、嗜血桿菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞桿菌屬、奈瑟氏球菌屬、葡萄球菌屬和根瘤菌屬等 20 多種菌。轉(zhuǎn)化性狀也多樣：如形態(tài)變化、莢膜物質(zhì)、糖發(fā)酵、耐藥性、抗原性、致病力、代謝產(chǎn)物、營(yíng)養(yǎng)需要等的變化。一般轉(zhuǎn)化率為 0.1 ％一 1 ％。

如果把噬菌體或其他病毒的 DNA （或 RNA ）抽提出，用它去感染感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并進(jìn)而產(chǎn)生正常的噬菌體或病毒后代，這種特殊的轉(zhuǎn)化稱為轉(zhuǎn)染。

二、轉(zhuǎn)導(dǎo) (transduction)

1952 年 Zinder 和 Lederberg 在驗(yàn)證鼠傷寒沙門氏菌是否也存在接合現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。

通過缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞的 DNA 片段攜帶到受體細(xì)胞中，通過交換與整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。獲得新性狀的受體細(xì)胞，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子 (transductant) 。攜帶供體部分遺傳物質(zhì) (DNA 片段 ) 的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。在噬菌體內(nèi)僅含有供體菌 DNA 的稱為缺陷噬茵體；在噬菌體內(nèi)同時(shí)含有供體 DNA 和噬菌體 DNA 的稱為部分缺陷噬菌體 ( 部分噬菌體 DNA 被供體 DNA 所替換 ) 。根據(jù)噬菌體和轉(zhuǎn)導(dǎo) DNA 產(chǎn)生途徑的不同，可將轉(zhuǎn)導(dǎo)分為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。

1、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) (general transduction)

通過缺陷噬菌體對(duì)供體菌任何 DNA 小片斷的“誤包”，而實(shí)現(xiàn)其遺傳性狀傳遞至受體菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象，稱為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。

普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制——“包裹選擇模型”，當(dāng)噬菌體侵染敏感細(xì)菌并在細(xì)菌內(nèi)大量復(fù)制增殖時(shí)，亦把寄主 DNA 降解為許多小的片段，在裝配時(shí)，少數(shù)噬菌體 (10 -6 一 10 -8 ) 錯(cuò)誤地包裝了宿主的 DNA 片段并能形成“噬菌體”，這種噬菌體稱普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體 ( 為缺陷噬菌體 ) 。隨著細(xì)菌的裂解，轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體也被大量釋放。當(dāng)這些轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體再次侵染受體菌時(shí)，其中的供體 DNA 片段被注入受體菌。

如果該 DNA 片段能與受體菌 DNA 同源區(qū)段配對(duì)，通過遺傳物質(zhì)的雙交換而進(jìn)行基因重組并形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子，稱普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。如鼠傷寒沙門氏菌的 P22 噬菌體、大腸桿菌的 P1 噬菌體和枯草芽孢桿菌的 PBS1 和 SP10 等噬菌體中都能進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。

如果該 DNA 片斷不能與受體菌 DNA 進(jìn)行交換、整合和復(fù)制，只以游離和穩(wěn)定的狀態(tài)存在，而僅進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和性狀表達(dá)，稱流產(chǎn)轉(zhuǎn)異。發(fā)生流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞在其進(jìn)行分裂后，只能將這段外源 DNA 分配給一個(gè)子細(xì)胞，而另一子細(xì)胞僅獲得供體基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯而形成的少量產(chǎn)物 -- 酶，因此在表型上仍可出現(xiàn)輕微的供體菌特征，每經(jīng)分裂一次，就受到一次“稀釋”。所以能在選擇培養(yǎng)基上形成微小菌落就成了流成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的特點(diǎn)。

2、局限性轉(zhuǎn)導(dǎo) (specialized transduction)

通過部分缺陷噬的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并獲得表達(dá)的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象）。轉(zhuǎn)導(dǎo)后獲得了供體部分遺傳特性的重組受體細(xì)胞稱為局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子。

（1）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制——“形成模型” λ噬菌體的線狀雙鏈 DNA 分子的兩端為 12 個(gè)核苷酸單鏈（粘性未端 cos 位點(diǎn)），在溶源狀態(tài)下，以前噬菌體狀態(tài)存在于細(xì)胞染色體上。被誘導(dǎo)后，在裂解細(xì)菌時(shí)，其以粘性末端形成的環(huán)狀分子通過滾環(huán)復(fù)制形成一個(gè)含多個(gè)基因組的 DNA 多聯(lián)體，以 2 個(gè) cos 位點(diǎn)之間的距離決定其包裝片段的大小而進(jìn)行切割、包裝，最終形成轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。在極少數(shù)情況下 ( 約 10 -5 ) ，在前噬菌體兩端鄰近位點(diǎn)上與細(xì)菌染色體發(fā)生錯(cuò)誤的切割，使其重新形成的環(huán)狀 DNA 中，同時(shí)失去前噬菌體的一部分 DNA 和增加了一段相應(yīng)長(zhǎng)度的細(xì)菌宿主染色體 DNA ，這樣形成的雜合 DNA 可正常被包裝、復(fù)制。形成的新轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體稱為部分缺陷噬體。因?yàn)棣饲笆删w位點(diǎn)兩端是細(xì)菌染色體的 gal + ( 發(fā)酵半乳糖基因 ) 和 bio + ( 利用生物素基因 ) ，故形成的轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體通常帶有 gal + 或 bi0 + 基因，故這些部分缺陷噬菌體表示為λ dga1( 缺陷型半乳糖轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體 ) 或λ dbio( 缺陷性生物素轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體 ) 。這些轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體可重新侵入受體菌，侵入后，噬菌體 DNA 與受體菌的 DNA 同源區(qū)段配對(duì)，通過雙交換而整合到受體菌的染色體組上，使受體菌獲得了供體的這部分遺傳特性。

（2）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)中的低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)與高頻轉(zhuǎn)導(dǎo) 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) (LFT) ：由于宿主染色體上進(jìn)行不正常切離的頻率極低，因而在裂解物中所含的部分缺陷噬菌體的比例是極低（ 10 -4 --10 -6 ）的，這種裂解物稱為 LFT 裂解物。 LFT 裂解物在低 m.o.i(multiplicity of infection) 情況下感染宿主，就可獲得極少量的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。高頻轉(zhuǎn)導(dǎo) (HFT) ：形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的頻率很高，理論上可達(dá) 50 ％，故稱之為高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。其原因是因?yàn)楣w菌為雙重溶源菌，它同時(shí)有兩種噬菌體整合在細(xì)菌的染色體上。例如，大腸桿菌 K12 株，其雙重溶源菌為 E.coli K12( λ / λ dg), 即其前噬體體有λ和λ dg 為缺陷噬菌體，帶有供體 gal + 基因，但丟失了部分噬菌體本身的 DNA ；而λ噬菌體為正常噬菌體，不帶 gal 基因，但起輔助作用，稱為輔助噬菌體，可彌補(bǔ)λ dg 的不足，使λ dg 也能成為“完整噬菌體”而釋放。這樣，一個(gè)細(xì)菌便可同時(shí)等量地釋放出λ dg 和λ兩種噬菌體，這時(shí)的裂解物稱為 HFT 裂解物，當(dāng)用低   m.o.i 的 HFT 裂解物去感染另一個(gè) E.coligal - 受體菌，是可高頻率的把它轉(zhuǎn)化為能發(fā)酵乳糖的 E.coligal + 轉(zhuǎn)導(dǎo)子。這種方式稱為高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。

當(dāng)溫和噬菌體感染其宿主而使之發(fā)生溶源化時(shí)，因噬菌體的基因整合到宿主的基因組，而使后者獲得了除免疫以外的新性的現(xiàn)象，稱為溶源轉(zhuǎn)變。

三、接合 (conjugation)

指供體菌和受體菌完整細(xì)胞間的直接接觸，而實(shí)現(xiàn)大段的 DNA 傳遞現(xiàn)象。

Iederberg 和 Tatum 于 1946 年設(shè)計(jì)了一個(gè)有名的實(shí)驗(yàn)，才證明了原核生物的接合現(xiàn)象。他們篩選出了兩種不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型的大腸桿菌 K12 突變株，其中 A 菌株是 met- 、 bio- ， B 菌株是 thr- 、 Leu- ，將它們?cè)谂囵B(yǎng)基上混合培養(yǎng)后，再涂布于基本培養(yǎng)基上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在基本培養(yǎng)基上出現(xiàn)了 met + 、 bi0 + 、 thr + 、 1eu + 的原養(yǎng)型菌落 ( 約為 10 -7 ) ，而分別涂布的兩種親本菌株對(duì)照組都不出現(xiàn)任何菌落。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，上述遺傳重組的形成，是兩個(gè)親本細(xì)胞接合以后發(fā)生基因重組的結(jié)果。在細(xì)菌中，接合現(xiàn)象發(fā)研究最清楚的是 E.coli ，研究發(fā)現(xiàn) E.coli 是有性別分化的，決定性別的是一種質(zhì)粒，即 F 因子。現(xiàn)在根據(jù) E.coli 細(xì)胞中是否存在 F 因子以及在細(xì)胞中的存在方式不同，可把大腸桿菌分成以下四種類型。

F + 菌株 F 因子以游離狀態(tài)存在，可獨(dú)立于染色體進(jìn)行自主復(fù)制。一般有 1-4 個(gè)，且細(xì)胞表面有相當(dāng)數(shù)量的性菌毛。

F - 菌株 不含 F 因子，無相當(dāng)數(shù)量的性菌毛。

Hfr 菌株 F 因子整合在宿主染色體的一定部位，并與宿主染色體同步復(fù)制。發(fā)現(xiàn) Hfr 與 F - 菌重組的頻率要比 F + 菌與 F - 菌重組的頻率高得多。

F ′菌株 因?yàn)?F 因子整合到染色體上是一種可逆過程，當(dāng) F 因子從 Hfr 菌染色體上脫落時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一定概率的錯(cuò)誤基因交換，從而使 F 因子帶上宿主染色體的遺傳因子，這時(shí)的 F 因子稱為 F ′因子。

幾種接合的結(jié)果

F+ × F- 接合 通過 F + 菌產(chǎn)生的性菌毛把兩者連接在一起，并在細(xì)胞間形成胞質(zhì)橋 ( 或稱接管 ) ， F 因子通過胞質(zhì)橋進(jìn)入受體細(xì)胞，使重組體從 F - 變成了 F + 菌。其主要過程是， F 因子的一條 DNA 單鏈斷裂 ( 在特定位點(diǎn)上 ) 、解鏈，并單向轉(zhuǎn)移進(jìn)入受體細(xì)胞，在此作為模板而形成新的 F 因子；另一條在供體細(xì)胞內(nèi)的 DNA 鏈也成為模板并以滾環(huán)模型形式復(fù)制；最終供體菌及受體菌均成為 F + 菌。

Hfr × F- 接合 當(dāng) Hfr 與 F- 菌株發(fā)生接合時(shí)， Hfr 的染色體雙鏈中的一條單鏈在 F 因子處發(fā)生斷裂，由環(huán)狀變?yōu)榫€狀， F 因子則位于線狀單鏈 DNA 之末端。整段線狀染色體也以 5- 末端引導(dǎo)，等速轉(zhuǎn)移至 F - 細(xì)胞。在沒有外界因素干擾的情況下，這一轉(zhuǎn)移過程的全部完成約需 100 分鐘。實(shí)際上由在轉(zhuǎn)移過程中，使接合中斷的因子很多，因此這么長(zhǎng)的線狀單鏈 DNA 常常在轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生斷裂。所以處在 Ffr 染色體前端的基因，進(jìn)入 F- 的幾率就越高，這類性狀出現(xiàn)在接合子中的就越早。由于 F 因子位于線狀 DNA 的末端，進(jìn)入 F- 細(xì)胞的機(jī)會(huì)最少，故引起 F- 變成 F+ 的可能性也最小。因此 Hfr 與 F- 接合的結(jié)果其重組頻率雖，但轉(zhuǎn)性頻率卻。

F ′與 F- 接合 通過 F ′與 F- 的接合就可以使后者變成 F ′。它既可使后者前者的 F 因子，同時(shí)雙獲得前者的部分遺傳性狀。

四、原生質(zhì)體融合（ protoplast fusion ）

通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并進(jìn)而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時(shí)帶有雙親性狀的、遺傳性穩(wěn)定的融合子（ fusant ）的過程 .

能進(jìn)行原生質(zhì)體融合的細(xì)胞是極其廣泛的，不僅包括原核生物，而且還包括各種真核細(xì)胞。原生質(zhì)體融合的性在于：

1、它打破了微生物的種屬界限，可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣菌株的基因重組。 1981 年 Yamada 有 PEG 誘導(dǎo)酵母原生質(zhì)體與細(xì)菌細(xì)胞成功的融合，并使其固氮作用或光合作用實(shí)現(xiàn)了不穩(wěn)定的表達(dá)。

2、原生質(zhì)融合可使遺傳物質(zhì)傳遞更為完整、獲得更多基因重組體的機(jī)會(huì)，有利于提高育種速度。

此外原生質(zhì)體融合技術(shù)還可用于研究細(xì)胞質(zhì)遺傳、核質(zhì)關(guān)系等問題，因此原生質(zhì)體融合技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐及理論研究上均有具有重要意義。

原生質(zhì)體融合技術(shù)及育種步驟

1、原生質(zhì)體的制備

制備原生質(zhì)體是保證實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)融合技術(shù)的關(guān)鍵。主要是要去除細(xì)胞壁。

2、原生質(zhì)體再生

是指去壁后的原生質(zhì)體能重建細(xì)胞壁，恢復(fù)細(xì)胞完整形態(tài)，并能生長(zhǎng)、分裂的過程。這是原生質(zhì)融合育種的必要條件。通常在原生質(zhì)體融合前要測(cè)定原生質(zhì)體的再生率，以此分析其融合率不高是由于雙親株原生質(zhì)體本來就沒有活性或再生率低，還是由于融合條件不適所致。因此測(cè)定原生質(zhì)體形成率和再生率不僅可作為檢查、改善原生質(zhì)體形成和再生條件的指標(biāo)，也是分析融合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，改善融合條件的一個(gè)重要指標(biāo)。

3、原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合方法 主要有生物助融（通過病毒聚合劑如仙臺(tái)病毒等病毒和某些生物提取物等使原生質(zhì)體融合）、物理助融（離心沉淀、電脈沖等）、化學(xué)助融（通過化學(xué)助融劑如 PEG 加 Ca 2+ ）。

4、融合子的檢出與鑒定

原生質(zhì)體融合育種的主要目的在于迅速準(zhǔn)確地檢出各種類型的融合子，并通過鑒定、篩選等步驟，及時(shí)選出穩(wěn)定高產(chǎn)的融合子。

①融合子的檢出

直接檢出法 將融合液涂布于親株生長(zhǎng)所必要的營(yíng)養(yǎng)物或存在抑制雙親生長(zhǎng)的抑制物的再生平皿上。

間接法 用影印法

②融合子的鑒定

經(jīng)過傳代選出穩(wěn)定融合子，可從形態(tài)學(xué)、生理生化、遺傳學(xué)及生物學(xué)等幾方面進(jìn)行鑒定。如菌落形態(tài)和顏色變化，代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量， DNA 含量分析等。

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