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            上海北諾生物科技有限公司
            中級(jí)會(huì)員·14年
            
    
            
	       
            
            
            
                
                
            
                    
            聯(lián)系電話
            
                    
            
                                              15800960770
                                          
            
                
            
            
            
        
            
              
    
            
    
            


	
  
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            中級(jí)會(huì)員·14年
            
        
            
            
            
                                     
            
                        
            聯(lián)系人：
            
                        
            周經(jīng)理 劉經(jīng)理
            
                    
            
                                                                                  
            
                            
            電話：
            
                            
             021-57730393
            
                        
            
                                                    
            
                                
            手機(jī)：
            
                                
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            傳真：
            
								
            86-021-61496710
            
							
            
							                        
                                   
                                           
            
                              
            地址：
            
                              
            上海市徐匯區(qū)宜山路520號(hào)中華門大廈18樓D座
            
                            
            
                                                     
            
              
            個(gè)性化：
            
              
            
                                    
                                        www.bnbiotech.com
              
            
          
            
                          
            
          
            網(wǎng)址：
            
          
            www.bnbiotech.com
            
        
            
            
        
            
            
            
            
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            流式表面抗原染色方法
            2013-4-24　　閱讀(2629)
            

            
							
				
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            方案A：細(xì)胞懸液的表面抗原染色。
            方案B：一步法胞內(nèi)蛋白染色（細(xì)胞核）。
            小貼士：
            1、流式抗體要儲(chǔ)存于避光4度，嚴(yán)格避免凍融。
            2、流式抗體使用前要離心3min，避免貼壁蓋的損失，請(qǐng)勿斡旋混勻。
            3、避免細(xì)胞成團(tuán)，以免堵塞流式細(xì)胞儀。
            4、eFluor納米晶體抗體參照該品說明進(jìn)行改善。

             
            方案A: 細(xì)胞懸液的表面抗原染色
            實(shí)驗(yàn)材料：
            15×75mm圓底流式管或96孔板
            直標(biāo)一抗或純化抗體
            二抗（可選）
            抗小鼠CD32/16抗體（eBioscience Cat. No. 14-0161）
            人FC?R結(jié)合抑制劑（eBioscience Cat. No. 14-9161）
            流式染色液（eBioscience Cat. No. 00-4222）可自行配制
            eFluor納米晶體抗體染色液（eBioscience Cat. No. 00-3222；可選）
            7-AAD活度染色液（eBioscience Cat. No. 00-6993）或PI染色液（eBioscience Cat. No. 00-6990）
            實(shí)驗(yàn)流程： 
            1、按照樣品細(xì)胞制備方案制備懸浮細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×107/ml。
            2、（可選）封閉FCR介導(dǎo)的非特異性反應(yīng)：
            小鼠：染色之前加0.5ug-1ug/100ul CD16/32抗體，孵育20min。
            人類：染色之前加20ul 人FCR結(jié)合抑制劑孵育20min。
            3、等分細(xì)胞懸液，每管50ul，再補(bǔ)加50ul染色液。
            4、按照抗體說明書加入適量抗體，輕彈混勻。
            5、直標(biāo)抗體。

             
            方案B：淋巴組織細(xì)胞制備
            實(shí)驗(yàn)材料：
            60×15mm 的組織培養(yǎng)皿
            [5ml 注射器
            細(xì)胞過濾器（尼龍網(wǎng)過濾）
            eBioscience® 流式染色緩沖液 （eBioscience Cat. No. 00-4222）
            15ml或50ml的離心管。
            注意：
            Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate 1份加3份 Diluent 稀釋為工作液（1:4稀釋）。
            實(shí)驗(yàn)方案： 
            1、按照流式樣品要求制備單細(xì)胞懸液。
            2、按照流式表面染色方法標(biāo)記CD3和CD4。緩沖液洗滌一次，離心*棄上清。斡旋分散細(xì)胞。
            3、加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定細(xì)胞。室溫或四度避光孵育30-60min（小鼠樣品zui長(zhǎng)可以四度固定18小時(shí)）。
            4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。
            5、300g 室溫離心5min,棄上清。
            6、2ml 1×permeabilization buffer重懸細(xì)胞。
            7、300g 室溫離心5min,棄上清。
            8、加100ul 1×permeabilization buffer 重懸細(xì)胞后，加入二抗FOXP3 （或其他胞內(nèi)抗原抗體），室溫避光孵育20min。
            9、2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室溫離心5min,棄上清。
            10、加2ml 流式染色液，300g 室溫離心5min,棄上清。
            11、適量流式染色液重懸，即可上機(jī)檢測(cè)。同行對(duì)照依照上述步驟進(jìn)行。軟件分析結(jié)
            
      
            
      
      
            
    
            
    
            
  
            

            
		 







  
    
    				
			

		
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    

    

     
     
     
	 



	
	
	


            
	
            
		
            
			
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