藥用級(jí)醫(yī)用海藻糖的制備方法
1.微生物抽提法 微生物抽提法是以乳酸菌、酵母、霉菌及其它一些含海藻糖的菌體為提取源, 首先通過干燥、改變滲透壓等方法處理菌體, 使其體內(nèi)積累更多的海藻糖, 然后經(jīng)過乙醇等有機(jī)溶劑抽提、精制, 從而得到較高度的海藻糖晶體。這是傳統(tǒng)的海藻糖生產(chǎn)方法, 由于酵母中海藻糖含量較高, 可達(dá)細(xì)胞干重的20 , 通常以酵母提取為主
2.發(fā)酵法 發(fā)酵法是在一定的基質(zhì)上培養(yǎng)微生物, 通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖, 再從發(fā)酵液中提取精制而成, 其中能利用基質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖的微生物包括節(jié)桿菌屬、棒桿菌屬、短桿菌屬、諾卡氏菌屬、絲核菌屬、微球菌屬等。一般先通過誘變、細(xì)胞融合或基因重組選育產(chǎn)海藻糖高的菌株, 然后采用高濃度的培養(yǎng)基及高滲發(fā)酵, 并在發(fā)酵結(jié)束前讓菌體/ 饑餓02~ 3h, 從而得到含海藻糖較高的培養(yǎng)物。該方法的缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率低, 發(fā)酵液成分復(fù)雜, 海藻糖的提取、精制困難, 因而研究運(yùn)用先進(jìn)的生化分離技術(shù), 提高轉(zhuǎn)化率和度, 對(duì)于絳低生產(chǎn)成本, 促進(jìn)推廣應(yīng)用重要。
3.酶轉(zhuǎn)化法 酶轉(zhuǎn)化法是采用葡萄糖、麥芽糖或淀粉等為底物, 通過與海藻糖合成有關(guān)的酶的作用轉(zhuǎn)化成海藻糖。根據(jù)其作用底物, 主要分為葡萄糖、麥芽糖、淀粉為底物三種生產(chǎn)方法。 (1)以葡萄糖為底物 人們?cè)谘芯考?xì)菌、真菌和植物體內(nèi)海藻糖的生物合成途徑時(shí)發(fā)現(xiàn), 在生物體中廣泛存在的一條海藻糖合成途徑是利用海藻糖- 6-磷酸合成酶( EC21411115) 和海藻糖- 6-磷酸磷酸酯酶( EC31113112) 催化葡萄糖生成海藻糖, 其反應(yīng)式為: 圖1為以葡萄糖為底物合成海藻糖的反應(yīng)式 2.以麥芽糖為底物 以麥芽糖為底物的酶轉(zhuǎn)化法主要有兩種: （1）由麥芽糖生物合成海藻糖的途徑: 圖2為以麥芽糖為底物合成海藻糖的反應(yīng)式 該法具有較高的特異性和快速溫和等特點(diǎn), 但反應(yīng)需要高能物質(zhì)UDP 或高濃度磷酸鹽, 而且磷酸化酶極不穩(wěn)定, 轉(zhuǎn)化率只有60 , 難于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn); （2）在一些非常見細(xì)菌, 如脂肪桿菌和某些耐熱菌中發(fā)現(xiàn)一種海藻糖合成酶(trehalosesynthase), 它能將A,A-1,4-麥芽糖在分子內(nèi)重組成 A,A-1, 1-海藻糖。該酶具有較嚴(yán)格的底物一性, 只作用于麥芽糖生成海藻糖及從海藻糖生成麥芽糖, 前者的反應(yīng)明顯優(yōu)于后者。 3.以淀粉為底物 以淀粉為底物生產(chǎn)海藻糖也有兩條途徑: 條途徑是利用葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransfer GTase) 和淀粉酶(amylase) 將淀粉轉(zhuǎn)化成海藻糖, 轉(zhuǎn)化率可達(dá)8115, 這類酶廣泛存在于硫化葉菌科中, 種酶是分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基酶, 將麥芽寡糖水解產(chǎn)生的葡糖基轉(zhuǎn)移到麥芽寡糖還原末端葡糖基C1-OH位置, 產(chǎn)生A,A- 1, 1-葡糖基海藻糖; 淀粉酶水解葡糖基海藻糖生成海藻糖和麥芽寡糖, 該酶僅切割各種葡糖基海藻糖中與海藻糖相鄰的A, A- 1, 4-糖苷鍵, 是一種新型A-淀粉酶。這兩種酶熱穩(wěn)定性好, 淀粉價(jià)格便宜, 可望成為工業(yè)生產(chǎn)海藻糖的新途徑。 第二條途徑是通過存在于節(jié)桿菌Arthrobactersp.Q36以及微黃短桿菌Brevibacterium helvolum,Micrococcus roseus, Sulfolobusacidicaldarium等菌中的麥芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl- trehalosesynthase, MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyl-trehalose trehalohydrolase, MTHase)的協(xié)同作用, 將一定鏈長(zhǎng)的鏈淀粉轉(zhuǎn)化為海藻糖。麥芽寡糖基海藻糖合成酶是一種分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基酶, 催化麥芽寡糖(淀粉液化液) 還原端的葡萄糖基和相鄰的葡萄糖基間的A, A-1, 4-葡萄糖苷鍵轉(zhuǎn)化成A,A-1, 1-葡萄糖苷鍵, 生成麥芽寡糖基海藻糖; 麥芽寡糖基海藻糖水解酶一水解麥芽寡糖基海藻糖的麥芽寡糖基和海藻糖基間的A, A-1, 4-糖苷鍵, 以上兩種酶聯(lián)合作用, 每次從麥芽寡糖生成海藻糖和少兩個(gè)葡萄糖單位的麥芽寡糖。
4.基因重組法 基因重組法包括兩個(gè)方面: 一是利用工程微生物和酶工程改進(jìn)海藻糖生產(chǎn), 提高產(chǎn)量, 降低成本;二是利用與合成海藻糖相關(guān)的基因構(gòu)建具有抗逆性的轉(zhuǎn)基因植物。Kim等克隆了非病原菌Brevibacterium helvolum中麥芽寡糖基海藻糖合成酶(BvMTS)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(BvMTH)的基因, 并將兩者重組成新基因BvMTSH, 轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá), 表達(dá)出的重組蛋白可的將可溶性淀粉轉(zhuǎn)化成海藻糖。 5.化學(xué)合成法 海藻糖的化學(xué)合成主要是在2，3，4，6—四乙配基—D—葡萄糖和3，4，6—三乙酰—1.2 —脫水—D—葡萄糖之間產(chǎn)生環(huán)氧乙烷加成反應(yīng)。在后一種化合物濃縮過程中也有海藻糖生成。然而海藻糖的化學(xué)合成具有較多的缺點(diǎn)，其中主要一點(diǎn)是產(chǎn)率低，分離困難， 至今還處于研究階段。
藥用級(jí)醫(yī)用海藻糖的制備方法
