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1.1 轉(zhuǎn)化細(xì)胞細(xì)胞鋪板:將細(xì)胞按70%的匯合度接種到96孔板。
1.2 轉(zhuǎn)染:16h后轉(zhuǎn)染螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和RNA,每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)復(fù)孔
(1)配制DNA和轉(zhuǎn)染試劑: 96孔板轉(zhuǎn)染質(zhì)粒時(shí)每孔比例為pLenti:Firefly:Renilla:轉(zhuǎn)染試劑=0.2μg:0.1μg:0.01μg:0.25μL
(2)稀釋好DNA及轉(zhuǎn)染試劑,常溫孵育5min
(3)將稀釋好的DNA分別和轉(zhuǎn)染試劑混勻,常溫孵育20min
(4)每孔棄去15μL培養(yǎng)基,將15μL DNA轉(zhuǎn)染混合液添加到每孔細(xì)胞樣品中
(5)轉(zhuǎn)染6h后,換新鮮*培養(yǎng)基
2 轉(zhuǎn)化細(xì)胞雙報(bào)告基因檢測(cè)
(1)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染48h后,棄去培養(yǎng)基,用100μL 1XPBS洗1遍
(2)傾斜96孔板,吸干剩余的PBS
(3)去離子水將5XPLB稀釋成1XPLB,使用前放到常溫
(4)每孔加50μL稀釋好的1X PLB,搖床常溫條件下?lián)u15min,進(jìn)行裂解
(5)白色不透光的96孔酶標(biāo)板中每孔加步驟4的上清液10μL,加入100μL預(yù)先混好的LAR II,2s后測(cè)數(shù)據(jù)
(6)每孔添加100μL預(yù)先混好的Stop&Glo Reagent,靜止2s后,測(cè)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞
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