West Femto ECL化學(xué)發(fā)光底物顯色與信號(hào)檢測(cè)

產(chǎn)品介紹：
WestFemto 最高靈敏度底物是用于辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物
本產(chǎn)品特點(diǎn)：
1、 靈敏—使用適當(dāng)?shù)囊豢购投箷r(shí)，可在硝化纖維膜或 PVDF 膜上檢測(cè)豐度為飛克級(jí)的蛋白條帶
2、定量—所得信號(hào)的可定量檢測(cè)范圍跨越兩個(gè)數(shù)量級(jí)。 • 明亮信號(hào)—通過(guò)膠片或成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光，易于捕獲圖像。
3、長(zhǎng)信號(hào)持續(xù)時(shí)間—優(yōu)化條件下，可檢測(cè)的光信號(hào)輸出長(zhǎng)達(dá) 8 小時(shí)。
4、穩(wěn)定試劑—試劑盒組分能夠在 4°C 條件下穩(wěn)定放置一年，在室溫下可穩(wěn)定放置6 個(gè)月。
5、價(jià)格經(jīng)濟(jì)—配方經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可適用于濃度極低的抗體檢測(cè)。
6、1ng至0.2μg/mL 一抗（以1μg/mL 儲(chǔ)存液稀釋 1:5,000 至 1:100,000 倍）
7、 2ng至10ng/mL 二抗（以1μg/mL 儲(chǔ)存液稀釋 1:100,000 至 1:500,000 倍） 當(dāng) West Femto 底物與優(yōu)化的抗體濃度和封閉緩沖液配合使用時(shí)，可檢測(cè)到常規(guī) ECL 底物無(wú)法檢 測(cè)的低豐度靶標(biāo)蛋白。
使用方法：
注：優(yōu)化抗原和抗體的濃度。必須使用建議的抗體稀釋度，以保證陽(yáng)性結(jié)果。有關(guān)建議的稀釋度范 圍請(qǐng)參考其他所需材料。
1) 將一抗?jié)舛认♂尩?1ng 至 0.2μg/mL（以 1μg/mL 儲(chǔ)存液稀釋 1:5,000 至 1:100,000 倍） 2) 將二抗?jié)舛认♂尩?2ng 至 10ng/mL（以 1μg/mL 儲(chǔ)存液稀釋 1:100,000 至 1:500,000 倍） 3) 將兩種底物組份按 1:1 比例混合，制備底物工作液。 注：暴漏于日光或任何其他強(qiáng)光可能損害工作液，為獲得優(yōu)良結(jié)果，將此工作液保存在琥珀色瓶中， 并避免長(zhǎng)期暴漏于任何強(qiáng)光。短時(shí)間暴漏于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)照明不會(huì)損害該工作液。
4) 將印跡膜在 WestFemtoECL 底物工作液中孵育5分鐘。
5) 吸出多余試劑。用清潔的塑料膜蓋住該印跡膜。
6) 使印跡膜在 X 光膠片上曝光。
蛋白印跡法詳細(xì)操作步驟
1) 將印記膜從蛋白轉(zhuǎn)印設(shè)備中取出，加入合適的封閉液在溫室下孵育 20-60 分鐘，同時(shí)振蕩。以封閉膜上非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)。 請(qǐng)注意：使用在前文建議的抗體稀釋度是非常重要的。
2) 將膜從封閉液中取出，與一抗工作液在溫室孵育 1 小時(shí)，同時(shí)振蕩；或在 28℃孵育過(guò)夜，不振蕩。
3) 將足量的洗滌緩沖液加至膜上，保證緩沖液將膜wan全覆蓋。振蕩孵育≥5 分鐘，更換洗滌緩沖液 并重復(fù)該步驟 4-6 次。增加洗滌緩沖液體積，洗滌次數(shù)和洗滌時(shí)間有助于降低背景信號(hào)。 注：孵育前，膜在洗滌緩沖液中的短暫淋洗會(huì)提高洗滌效率。 請(qǐng)注意：使用在前文建議的 HRP 標(biāo)記二抗稀釋度是非常重要的。
4) 將 HRP 標(biāo)記的二抗工作液與膜在溫室孵育1小時(shí)，同時(shí)振蕩。
5) 重復(fù)步驟3，以除去未結(jié)合的HRP 標(biāo)記二抗。 注：膜與HRP標(biāo)記二抗孵育后必須進(jìn)行che底洗滌。
6) 將A溶液與B液等比例混合，制備成工作液。每cm2膜使用 0.01～0.1ml 工作液。工作液可以 在溫室下穩(wěn)定 8 小時(shí)。 注：暴漏雨日光或任何其他強(qiáng)光下可能損害工作液，為獲得嘴角結(jié)果，將此工作液保存在琥珀色瓶中，并避免長(zhǎng)期暴漏雨任何強(qiáng)光。實(shí)驗(yàn)室的常見(jiàn)照明不會(huì)損害工作液。
7) 將印記膜在工作液中孵育5分鐘。
8) 從工作液中取出印記膜，并置于一個(gè)塑料片或清潔的塑料紙（膜）中，用一張吸水紙吸除多余 的液體，并從印記和塑料紙之間小心地壓出氣泡。
9) 將包在塑料紙（膜）中的印記膜置于膠片暗盒中，蛋白質(zhì)面朝上，除適用于膠片曝光的燈（如 紅色安全燈）之外，關(guān)閉所有的燈。
注意：膠片必須在曝光期間保持干燥，為獲得優(yōu)良效果，采取以下措施：
* 確保將多余的底物從膜和塑料紙上wan全去除。
* 在整個(gè)膠片處理期間，使用手套。
* 切莫將印記膜置于已顯影的膠片上，因?yàn)槟z片上的化學(xué)物質(zhì)會(huì)減弱信號(hào)。
10) 將X光膠片置于膜的上面。建議第一次曝光 60 秒。之后可調(diào)整曝光時(shí)間以達(dá)到優(yōu)良結(jié)果?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)在底物孵育后的前 5-30 分鐘期間是zui強(qiáng)烈的。這一反應(yīng)可以持續(xù)幾個(gè)小時(shí)，但強(qiáng)度會(huì)隨時(shí)間下降，如有底物孵育后較長(zhǎng)時(shí)間后曝光，曝光時(shí)間可能需要延長(zhǎng)以獲得較強(qiáng)信號(hào)。如果使用 磷光存儲(chǔ)成像設(shè)備（如Bio-Rad的分子成像儀系統(tǒng)）或CCD 照相機(jī)可能需要較長(zhǎng)的曝光時(shí)間。
注意：膠片與膜之間的任何移動(dòng)可能在膠片上造成人為的非特異信號(hào)。 11) 使用合適的顯影劑和定影劑對(duì)膠片進(jìn)行顯影。如果信號(hào)太強(qiáng)，則縮短曝光時(shí)間或?qū)⒂∮浤みM(jìn)行 剝離并降低抗體濃度重新檢測(cè)。
重要提示：
1、為獲得優(yōu)良效果，必須優(yōu)化該系統(tǒng)的全部組分，包括樣品量、一抗和二抗?jié)舛纫约澳ず头忾]試劑的類型。
2、使用該產(chǎn)品比使用沉淀比色 HRP 底物檢測(cè)所需的抗體濃度低。為優(yōu)化抗體濃度，請(qǐng)進(jìn)行一次 系統(tǒng)的點(diǎn)印跡分析。
3、沒(méi)有一種封閉試劑對(duì)所有系統(tǒng)而言都是優(yōu)良的，所以為每一個(gè)免疫印跡檢測(cè)系統(tǒng)找到最合適的 封閉緩沖液非常必需。封閉試劑有可能與抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性信號(hào)。封閉緩沖液同時(shí)也會(huì)影響系統(tǒng)的靈敏性。當(dāng)從一種底物轉(zhuǎn)換為另一種底物時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)信號(hào)衰減或背景增加 的現(xiàn)象，原因可能是封閉緩沖液不適合新的檢測(cè)系統(tǒng)。
4、使用親和素/生物su檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，避免使用牛奶作為封閉試劑，因?yàn)榕Ｄ讨泻胁欢康膬?nèi)源性生物su，會(huì)導(dǎo)致高背景信號(hào)。
5、保證洗滌緩沖液、封閉緩沖液、抗體溶液和底物工作液的使用體積，以確保在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中 印跡膜wan全被液體覆蓋，避免膜變干。增大封閉緩沖液及洗滌緩沖液的使用量可以降低非特異性的 信號(hào)。
6、為獲得優(yōu)良效果，在孵育步驟請(qǐng)使用搖床。
7、 將 Tween20(終濃度 0.05-0.1%)加入封閉緩沖液和稀釋的抗體溶液，以降低非特異信號(hào)。使用高品質(zhì)的產(chǎn)品，如去污劑。它保存在安瓿中，過(guò)氧化物和其他雜質(zhì)含量很低。
8、不要使用疊氮鈉作為緩沖液的防腐劑。疊氮鈉是 HRP 的抑制物。
9、避免手與膜直接接觸，實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)戴手套或使用干凈的鑷子。
10、所有設(shè)備必須清潔且不沾染外來(lái)物質(zhì)。金屬器械（如剪刀）不得具有可見(jiàn)的銹跡。銹跡可能導(dǎo) 致斑點(diǎn)形成和高背景。
11、底物工作液在室溫下可穩(wěn)定8小時(shí)。日光或任何其他強(qiáng)光下可能損害底物，為獲得優(yōu)良結(jié)果，將底物工作液保存在琥珀色瓶中，并避免長(zhǎng)期暴漏在任何強(qiáng)光下，短時(shí)間暴漏于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)照明不會(huì)損害該工作液。

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