超氧陰離子(Oxygen free radical, OFR)試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

超氧陰離子試劑盒 氧化

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

生物體內(nèi)超氧陰離子等活性氧具有免疫和信號傳導(dǎo)的作用，但積累過多時會對細(xì)胞膜及生物大分子產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞和組織代謝異常，從而引起多種疾病。

測定原理：

超氧陰離子與鹽酸羥胺反應(yīng)生成NO2 ^-，NO2^-在對氨ji苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成紅色的偶氮化合物，在 530nm 處有特征吸收峰，根據(jù)ΔA 值可以計算樣品中 O2 ^-含量，反應(yīng)式為 NH2OH + 2O2 ^-＋H ⁺→ NO2 ^- ＋ H2O2 ＋ H2O。

試劑組成和配制：

自備儀器和用品：

天平、水浴鍋、離心機(jī)、可見分光光度計、1 ml 玻璃比色皿、氯仿和蒸餾水。

超氧陰離子提?。?/span>

1、植物、動物組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃，離心 20min，取上清置于冰上待測。。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 10000g， 4℃，離心 20min，取上清置于冰上待測。

3、血清或培養(yǎng)液：直接測定。

測定步驟：

混勻，37℃水浴 20min：

混勻，37℃水浴 20min

混勻，8000g，25℃，離心 5min，小心吸取上層水相 1ml， 1ml 玻璃比色皿，蒸餾水調(diào)零，測定 A530。 ΔA=A 測定-A 空白，空白管只要做一管。

超氧陰離子含量計算公式：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0242x - 0.0027，R2=0.9980

組織：

按照樣本質(zhì)量計算

超氧陰離子含量（nmol/g 鮮重）= (ΔA +0.0027)÷0.0242×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)×2

=148.76×(ΔA +0.0027)÷W

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ g·min）=148.76×(ΔA+0.0027)÷W÷T

=7.44× (ΔA +0.0027)÷W

按照蛋白質(zhì)濃度計算

超氧陰離子含量（nmol/mg prot）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反總÷(V 樣×Cpr)×2

=148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ mg prot·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr÷T

=7.44× (ΔA+0.0027)÷Cpr

細(xì)菌，真菌：

超氧陰離子含量（nmol/104 cell）= (ΔA+0.0027)÷0.0242× V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量)×2

= 148.76×(ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/104 cell·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量÷T

=7.44× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量

血清或培養(yǎng)液

超氧陰離子 含量（nmol/ml）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反總÷V 樣×2

=148.76× (ΔA+0.0027)

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ml·min）= 148.76× (ΔA+0.0027) ÷T

= 7.44× (ΔA+0.0027)

V 樣總：加入提取液體積，1 ml； V 反總：反應(yīng)總體積，0.9ml；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0.5ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，20min；2： 2 分子O2－參與反應(yīng)生成 1 分子 NO2－。

注意事項：

1、吸光值大于 2，樣品適當(dāng)稀釋再測定，注意計算公式里乘以稀釋倍數(shù)。

2、樣品制備好之后，立刻進(jìn)行測定，請勿將樣品進(jìn)行長時間的低溫保存，以免影響測定結(jié)果。

3、試劑四有一定的毒性，請操作時做好防護(hù)措施。

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