羥甲基戊二酰輔meiA 合成酶（HMGCS）試劑盒說(shuō)明書

微量法 100 管/96 樣

羥甲基戊二酰輔meiA合成酶試劑盒 三羧酸

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

羥甲基戊二酰輔meiA 合成酶是甲羥戊酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，催化乙酰 CoA 與乙酰乙酰CoA 生成羥甲基戊二酰CoA。

測(cè)定原理：

HMGCS 催化乙酰CoA 與乙酰乙酰CoA 生成羥甲基戊二酰CoA，同時(shí)產(chǎn)生 CoASH，使 DTNB 轉(zhuǎn)化為黃色的TNB，在 412nm 下有特征吸光值。

組成：

試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存；臨用前加入 3ml 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存；臨用前加入 3ml 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或

細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 412nm，蒸餾水調(diào)零。

2、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 25μl 試劑一、25μl 試劑二和 50μl 試劑三，混勻，加入 100μl 樣本上清，迅速混勻后記錄 412nm 下初始吸光值A(chǔ)1 和 4min 后的吸光值A(chǔ)2。計(jì)算ΔA＝A2-A1。

HMGCS 活性計(jì)算：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）活性

單位定義：每ml 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmolTNB 為一個(gè)酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /ml）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣 ÷T=36.76×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞HMGCS 活性

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmolTNB 為一個(gè)酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=36.76×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmolTNB 為一個(gè)酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T=36.76×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmolTNB 為一個(gè)酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /104 cel）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.074×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：TNB 摩爾消光系數(shù)，1.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.1 ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，4 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì) 濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

1、血清（漿）活性

單位定義：每ml 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmolTNB 為一個(gè)酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /ml）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣 ÷T=73.53×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞HMGCS 活性

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmolTNB 為一個(gè)酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=73.53×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmolTNB 為一個(gè)酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T=73.53×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmolTNB 為一個(gè)酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /104 cel）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.147×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：TNB 摩爾消光系數(shù)，1.36×104 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm； V 樣：加入樣本體積，0.1 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，4 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。

羥甲基戊二酰輔meiA合成酶試劑盒 三羧酸