磷酸烯醇式丙*酸羧激酶（PEPCK)試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

磷酸烯醇式丙*酸羧激酶試劑盒 糖異生系列

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

PEPCK（EC 4.1.1.32）廣泛存在于動物、植物、微生物和細(xì)胞中，催化草xian乙酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸，是調(diào)節(jié)糖異生途徑的關(guān)鍵酶。

測定原理：

PEPCK 催化草xian乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2，丙tong酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化 NADH氧化生成NAD⁺，在 340nm 下測定NADH 下降速率，即可反映 PEPCK 活性。

組成：

自備儀器和用品：

分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、試劑四的配制：臨用前加入 1ml 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

4、將工作液和試劑四置于 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)預(yù)熱 5 分鐘。

5、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本、10μl 試劑四和 180μl 工作液，立即混勻，記錄 340nm處初始吸光值A(chǔ)1 和 1min 后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A1-A2。

注意：在該試劑盒中，若ΔA 大于 0.1，需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測定，使ΔA 小于 0.1 可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

PEPCK 活性計算：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）PEPCK 活力計算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/ml））＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=3215×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 PEPCK 活力計算

按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=3215×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位定義：每 1 萬個細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=6.43×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

用 96 孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）PEPCK 活力計算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/ml））＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=6430×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 PEPCK 活力計算

按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=6430×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位定義：每 1 萬個細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=12.86×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

磷酸烯醇式丙*酸羧激酶試劑盒 糖異生系列