丙*酸羧化酶（PC)試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

丙*酸羧化酶PC試劑盒 糖異生系列

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

丙*酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)廣泛存在于動物、霉菌和酵母的線粒體中，催化丙酮酸、ATP、CO2 和水生成草酰乙酸、ADP 和Pi，是糖異生過程的第一個限速酶，在保證血糖的動態(tài)平衡方面起著重要的作用。

測定原理：

PC 催化丙酮酸、ATP、CO2 和水生成草酰乙酸、ADP 和Pi，蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和 NADH生成蘋果酸和NAD⁺，在 340nm 下測定NADH 氧化速率，即可反映 PC 活性。

組成：

自備儀器和用品：

分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細菌或細胞，加入 1ml 提取液，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 將勻漿 600g，4℃離心 5min。

3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

4、 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的 PC（此步可選做）。

5、 在步驟④的沉淀中加入 1ml 提取液，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復30 次），用于線粒體 PC 活性測定。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調零。

工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三轉移到試劑一中混合溶解待用；置于 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)預熱 5 分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑四的配制：在試劑四瓶中加入 1mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

2、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本、10μL 試劑四和 180μL 工作液，立即混勻，記錄 340nm處初始吸光值A1 和 2min 后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

注意：在該試劑盒中，若ΔA 大于 0.5，需將樣本用提取液稀釋適當倍數(shù)后測定，使ΔA 小于 0.5 可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù)。 

PC 活性計算：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下

按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=1608×ΔA÷W

按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PC（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=3.215×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。

用 96 孔板測定的計算公式如下

按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=3216×ΔA÷W

按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PC（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=6.43×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。

丙*酸羧化酶PC試劑盒 糖異生系列